第 13 讲 酶类药物

第 13 章 酶类药物

第一节 酶类药物的原料来源

 一、原料选择

选用原料应注意以下几点:

（1）不同酶的用料选择：哪里有，含量高，选哪。

（2）注意不同生长发育情况及营养状况, 用微生物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。用动物器官提取酶，则与动物年龄及饲养条件有关。

（3）从原料来源是否丰富考虑；

（4）从简化提纯步骤着手

（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即取材。

从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐渐转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。

二、微生物酶制剂高产菌株的选育

菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。与增加品种、缩短生产周期、改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。

优良菌种的获得有三条途径：

①是从自然界分离筛选：

②是用物理域化学方法处理、诱变；

③是用基因重组与细胞融合技术。因此微生物的分离筛选是一切工作的基础。

三、微生物酶制剂生产的发酵技术

首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量等。还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺。

（—）原料

利用微生物生产酶制剂的主要原料为碳源和氮源，此外还有无机盐、生长因素和产酶促进剂等。

如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时，这类物质通称为产酶促进剂。它们大多属于酶的诱导物或表面活性剂。

1、固体培养法

固体培养法亦称麸曲培养法 ，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基 。

2、液体培养法

液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养两种。

3、影响酶产生的一些因素

菌种的产酶性能是决定发酵效果的重要因素，但是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的。

（1）温度 一般发酵温度比种子培养时略高些，这样对产酶有利。

（2）pH 可用糖或淀粉调节，pH低则可用氨来调节。

（3）通气（供氧）临界氧浓度 。氧必须是溶解于培养基中的氧 。

（4）搅拌 增加液体湍流速度 ，减少气泡周围液膜厚度 。有利于促进细胞的新陈代谢。

（5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故 。

（6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成，诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂促进酶的形成 。加入适量表面活性剂 。

第二节 常见的酶类药物的提取和纯化

一、生物材料的预处理

（一）动物材料的预处理

1、机械处理

用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。

2、反复冻融

冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。

3、丙酮粉

组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。

（二）微生物的预处理

要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。

菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。

干燥法，因为干燥常能导致细胞自溶，增加酶的释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期目的。

1、干燥法： ①空气干燥 25～30℃ ②真空干燥还 原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶宜用此法。

2、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。

3、酶法处理

用得最多的是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下对小球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。

二、酶的提取

1、水溶液法

常用稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作。在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性溶液提取。

盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／L NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。

2、有机溶剂法

某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。

3、表面活性剂法

表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。

三、酶制剂的工业提取法

（一）发酵液的预处理及过滤

微生物发酵液的分离，过滤，发酵液中加絮凝剂或凝固剂 。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸 。

（二）酶液的脱色

活性炭、脱色树脂 。

（三）盐析法

用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。

（四）有机溶剂法

有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇 。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。

（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂

喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。

四、酶的纯化

评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。

酶在纯化过程中的一些技术难点：

（一）杂质的除去

酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等 。

（1）pH和加热沉淀法

（2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。

（3）选择性变性法

利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。

甚至可用2.5%三氯乙酸处理。

（4）核酸沉淀剂法

用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。

用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。

（5）将酶与底物结合

酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。

（二）脱盐和浓缩

1、脱盐

脱盐方法是透析和凝胶过滤。

2、浓缩

酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。

（三）酶的结晶

把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶的纯度经常有一定程度的提高。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品。

1、酶的结晶方法

酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。

（1）盐析法

操作要在低温下进行，加盐，缓冲液pH要接近酶的等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。

（2）有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。

一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的pH，缓慢地滴加有机溶剂 。使用的缓冲液一般不用磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐。

（3）复合结晶法 有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。

（4）透析平衡法

（5）等电点法

2、结晶条件的选择

（1）酶的纯度 酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的纯化作用。

（2）酶的浓度

（3）温度 结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。

（4）时间 结晶形成的时间,数小时到几个月，有的甚至需要1年或更长时间。一般来说，较大而性能好的结晶是在生长慢的情况下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。

（5）pH

调整pH可使结晶长到最佳大小，也可改变晶形。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近。

（6）金属离子

许多金属离子能引起或有助于酶的结晶，在酶的结晶过程中常用金属离子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。

（7）晶种 不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶，

（8）结晶器皿处理

结晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次。 结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目 ，形成大的结晶。

（四）酶分离和纯化工作的注意事项

1、防止酶蛋白变性

2、防止辅因子的流失

3、防止酶被蛋白水解酶降解

第三节 重要的酶类药物及其生产

 一、药用酶类的概述（略）

早期酶制剂主要用于治疗消化道疾病，烧伤及感染引起的炎症疾病，现在国内外己广泛应用于多种疾病的治疗，其制剂品种已超过700余种。

（一）促进消化酶类

（二）消炎酶类

（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类

（四）抗肿瘤的酶

（五）其它药用酶

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二、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。

1、组成（结构）、性质

药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后恢复期消化机能减退等。

2、生产工艺

（1）工艺路线：

胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。

常用的脱脂剂有乙醚、氯仿、四氯化碳。

（2）工艺过程

①自溶、过滤

在夹层锅内预先加水100L及盐酸，加热至50℃时，加入200kg猪胃粘膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45~48℃,消化3~4小时。用纱布滤去未消化的组织蛋白，收集滤液。

②脱脂、去杂质

将滤液降温至30℃以下，静防24~48h，使杂质沉淀除去，得到脱脂酶液。

③浓缩干燥

取脱脂酶液，在40℃以下浓缩到原体积的1/4，真空干燥，球磨，得到产品。

（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60％丙酮沉淀分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至比重为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。

（4）结晶胃蛋白酶的制备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4调pH3.0，5℃静置20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析。盐析物再在pH3.8～4.0的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8～2.0，即析出针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20% pH4的乙醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8，在20℃放置，可得板状或针状结晶。

三、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）

尿激酶，是一种碱性蛋白酶。由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。人尿平均含量5～6国际单位／m1。临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。

1、组成（结构）性质

（1）尿激酶有多种分子量形式。尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶降解成为尿激酶。

（2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸-缬氨酸键使纤溶酶原转为纤溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。

（3）尿激酶的pI(等电点)为pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。

2、生产工艺

（1）工艺路线：

（2）工艺过程

①收尿 收集男性尿

②沉淀处理 尿液冷至10℃以下，用NaOH调pH至8.5,静置1h，虹吸上清液。用盐酸调至pH5.0~5.5。

③硅藻土吸附 处理好的尿液加入1%尿量的硅藻土，于5C下搅拌吸附1h。

④洗脱 硅藻土吸附物洗涤装柱，先用0.02%氨水加0.1mol/L氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集

⑤除热源、去色素

⑥CM－C浓缩

⑦透析除盐

四、L-天门冬酰胺酶 （L-asparaginase）

1、组成（结构）、性质

L-天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。

性状呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。最适pH8.5，最适温度37℃。

L-天门冬酰胺酶的产生菌是霉菌和细菌，故可作制造酶的原料。

2、生产工艺

（1）工艺路线：

五、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase SOD）

超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国有产品，此酶属金属酶，它催化的化学反应是：

由于SOD能专一清除超氧阴离子自由基（O2-）；故引起国内外生化界和医药界的极大关注。目前SOD临床应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎、红斑性狼疮、皮肌炎、肺气肿等；也用抗辐射，抗肿瘤、治疗氧中毒、心肌缺氧与缺血再灌注综合征以及某些心血管疾病。

1、组成（结构）、性质

SOD属金属酶，其性质不仅取决于蛋白质部分，还取决于活性中心金属离子的存在。按金属离子种类不同，SOD有Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。三种酶都催化同一反应，但其性质有所不同，其中Cu，Zn-SOD与其它两种SOD差别较大，而Mn-SOD与Fe-SOD之间差别较小。

（2）SOD的活性中心和构象比较特殊，金属辅基Cu和Zn与必需基团His等形成咪唑桥 。

（3）SOD的理化性质 SOD是一种金属蛋白，因此它对热、对pH及在某些性质上表现出异常的稳定性。

①对热稳定性 SOD对热稳定。但SOD对热稳定性与溶液的离子强度有关，如果离子强度非常低，即使加热到95℃，SOD活性损失亦很少。

②pH对SOD的影响 SOD在pH5.3～10.5范围内其催化速度不受影响。如pH3.6时SOD中Zn要脱落95％，pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，导致酶活性丧失。

③吸收光谱

④金属辅基与酶活性 SOD是金属酶，Cu与Zn的作用是不同的，Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关，而Cu与催化活性有关，透析去除Cu则酶活性全部丧失，一旦重新加入Cu，酶活性又可恢复。同样， Mn和Fe与Cu一样，对酶活性是必需的。

2、生产工艺

（1）牛红细胞提取Cu，Zn-SOD的生产工艺：

DEAE－SephadexA50柱层析

（2）工艺过程

1）收集、浮选 取新鲜牛血，离心除去血浆。

2）溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血30min，然后加入0.25倍体积的乙醇和0.15倍体积的氯仿，搅拌15min，离心去血红蛋白，收集上清液。

3）沉淀、热变性：将上述清液加入1.2～1.5倍体积的丙酮，产生大量絮状的沉淀，离心得沉淀物。再将沉淀物加适量水，离心去不溶物，上清液于60～70℃热处理10分钟，离心去沉淀得浅绿色得澄清液。

4）柱层析、洗脱、超滤浓缩：将上述澄清液超滤浓缩后小心加到已用2.5mmol/L，pH7.6磷酸缓冲液平衡好的DEAE－sephadex A50柱上吸附，并用pH7.6的2.5～50mmol/L的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活性的洗脱液。

5）冷冻干燥

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