干扰素的研究进展及应用前景

干扰素的研究进展及应用前景

高等生物化学中期答辩

作者：ZJJ

学院：化学化工学院

专业：药物化学

学号：

干扰素的研究进展及应用前景

作者：

摘要：干扰素是人体受到病毒或双股RNA刺激物的刺激产生免疫应答，由细胞合成及分泌的一族蛋白质类，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用,是机体防御系统的重要组成部分。它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。本文就干扰素的分类、分子结构、作用机理、生物学活性、体外重组技术以及临床应用等方面的研究进展进行了综述，并对其应用前景做出预测展望。

关键词：干扰素 研究进展 应用前景

Research progress and application prospect of interferon

Author:

( Tianjin University of Technology, Tianjin 300072,China)

Interferon (IFN) is human body gets virus or double stranded the exciting generation immunity of RNA exciter is respondent, by the cell synthesis reaches excretive gens protein kind ,has the function of regulating the immune function, antiviral and antitumor, is an important part of the body's defense system. It can prevent or limit viral infection by interfering with viral gene transcription or translation of the viral proteins，so it is the main antiviral and antitumor biological products.The research of interferon classification, molecular structure, mechanism of action, biological activity, vitriol recombination techniques and related research development of clinical application are reviewed in the paper, and forecasts the prospect to its application prospect.

Key words: Interferon Research progress Application Prospects

前 言

干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白，由Isaacs和Lindenmann等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的。干扰素自被发现以来，其广谱的抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视。近年来，IFN已经成为病毒学、细胞学、分子遗传学、免疫学、生化学、肿瘤学、以及临床学家研究的重点对象，有逐步形成一个新兴边缘学科的趋向。该文章是对干扰素的研究进展及发展前景进行综述。

1.干扰素的产生机理与分类

1.1干扰素的产生机理

IFN是人和动物在细胞受到适宜刺激条件下产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白。IFN的产生是受细胞基因组控制的，由于细胞中IFN基因抑制物（IFN surpressor）与IFN基因结合抑制复制酶系统，所以一般情况下，IFN基因处于抑制状态。当病毒或者其他诱生剂作用于细胞膜后，使IFN基因脱解抑制。IFN操纵子开始转录，合成mRNA,mRNA迅速转移至细胞浆，在核糖体上转议成IFN前体，切除信号肽后，成熟的IFN分泌到细胞外[1-2]。

1.2 干扰素的分类

在过去,干扰素是按其与受体结合的原则,分为Ⅰ型和Ⅱ型,后来发现Ⅰ型干扰素按其与抗体结合的抗原性不同又可分为二类,故把Ⅰ型干扰素又分为A、B两大类,将原来的Ⅱ型干扰素命名为γ,此后30多年都把干扰素分为A、B、C三大类,其中虽然有很多人声称发现了第四、第五类干扰素等,但均未得到国际干扰素和细胞因子研究学会(ISICR)的肯定,最后均被否定。直到近几年,干扰素的研究又有了十分重大的突破性进展。新发现的IFN-K1(lambda1)、IFN-K2和IFN-K3,或IL-28A、IL-28B和IL-29都有干扰素活性,但它结合的受体与Ⅰ型干扰素受体不同[3-4]。

这些新发现的干扰素,按其与受体结合的不同，将IL-28A、IL-28B、IL-29或IFN-K1 (lambda 1)、IFN-K2和IFN-K3命名为Ⅲ型干扰素。所以,按干扰素与其结合的受体不同分为TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。干扰素的具体分类如下:Ⅰ型干扰素包括IFN-A(亚型IFNA-1、2、3等；亚亚型IFNα-1a、1b、1c或IFNα-2a、2b、2c等);IFN-β;IFN-κ;IFN-ε;IFN-ω等。Ⅱ型干扰素即过去的IFN-γ。Ⅲ型干扰素包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3[5]。

2.干扰素的生物活性及作用机理

2.1 干扰素的生物学特性

2.1.1　高度的生物活性　

IFN具有广谱抗病毒活性,一种IFN既可抑制多种RNA病毒,又可抑制多种DNA病毒。不同病毒对IFN的敏感性不同,有囊膜的病毒最敏感。不仅不同种类的病毒对IFN的敏感性有差异,而且同一种的不同变种对IFN的敏感性也不完全相同。除广谱抗病毒活性外,IFN还能抑制病毒以外其他微生物的生长,抑制细胞分裂,抑制肿瘤细胞增殖和参与调节免疫应答。

2.1.2　相对的种属特异性　

IFN的活力具有相对的种属特异性,即某一种属动物(或组织细胞)产生的IFN只能对同种属或种属非常接近的动物或细胞有保护力,即IFN活力在同种细胞上高,在异种细胞上低。鸡IFN在鸡细胞上,1/4000的滴度即可抵御水泡性口炎病毒(VSV)的攻击,而在鼠细胞上,滴度1/30仍不能保护。但是这种特异性是相对的,不是绝对的,如猴细胞产生的IFN除对猴有保护作用外,对人和兔的细胞也有一定的保护作用。

2.1.3　微弱的抗原性　

1975年有人报告,用鼠或鸡IFN免疫兔或豚鼠,每周1次,在第10次出现抗体,第18次以后抗体滴度稍高。也有人报告,用人和兔的IFN免疫豚鼠,每周1次,持续半年才获得中和抗体。

2.2抗病毒作用及作用机理

IFN-α、β、γ均有抗病毒作用[6]。动物试验结果证明,IFN-C抗病毒活性远较Ⅰ型低,IFN-C和IFN-B能相互加强抗病毒作用。IFN抗病毒具有广谱性,但它对细胞抗病毒作用是间接的,而且是非特异性[7]。病毒感染细胞导致IFN的产生,并随被感染细胞死亡、崩解而释出。IFN分子向附近扩散,随血液循环至全身。IFN

图2.2.1 干扰素抗病毒作用

Fig2.2.1 Antiviral effect of interferon

是由宿主细胞编码的蛋白质,因其是通过作用于靶细胞,激活靶细胞内的基因而发挥作用的,故其具有广谱抗病毒作用。当IFN进入细胞后,干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后,可诱导细胞产生具有酶活性的抗病毒蛋白(AntivirualProtein,AVP)。已经知道的AVP至少有3种:蛋白激酶、磷酸二脂酶和2.-5.寡腺苷酸合成酶[8]。蛋白激酶和磷酸二脂酶能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质, 2.-5.寡腺苷酸合成酶能降解mRNA。这些抗病毒蛋白或抑制转录酶,阻止mRNA的形成,或抑制病毒DNA和RNA的合成。因此,可以说干扰素是通过AVP间接地抑制病毒的增殖而达到抗病毒作用。

2.3 免疫调节作用及作用机理

干扰素具有很强的免疫调节作用。它可以调节T、B淋巴细胞的免疫功能,小剂量起促进作用,大剂量起抑制作用。干扰素也可增加IgG的Fc受体表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，K细胞、NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力。IFN或IFN诱生剂处理后,可引起IFN敏感细胞表面抗原和某些受体的表达增加。。另外，IFN还能影响抗原提呈作用，如 IFN-γ 能显著增加抗原提呈细胞表达 MHC-Ⅱ类抗原的数量，增强抗原提呈细胞与 T 细胞的相互作用，增加辅助 T 细胞的数量并增强迟发型超敏反应。IFN 具有巨噬细胞活化因子的作用，能引发巨噬细胞的杀肿瘤效应。IFN-A/B主要是通过对淋巴细胞和巨嗜细胞的调节或诱导MHC I型分子的表达起免疫调节作用的[10]。IFN-α/β能诱导淋巴细胞释放肿瘤坏死因子(TNF),启动细胞毒性T细胞(CLT)和NK细胞的分化; IFN-α/β能诱导巨嗜细胞提高Fc受体的表达,增强巨嗜细胞吞噬抗原的能力; IFN-α/β能诱导病毒感染细胞和肿瘤细胞提高MHC I型分子的表达水平,增强免疫系统对其的清除作用。近年来研究发现, IFN-α/β在先天性免疫与获得性免疫的转变过程中起主要的作用。IFN-α/β这一主要功能以树突状细胞的产生和激活为纽带[11]。

IFN-γ对抑制性T细胞的作用有双向性［12］。一方面,IFN-γ可激活NK等细胞,增强抗病毒、抗肿瘤的功能;另一方面,它能抑制B细胞分泌IgE,从而避免因IgE水平过高而发生Ⅰ型超敏反应,它还能恢复抑制性T细胞的功能,减少免疫复合物的局部沉积,抑制Ⅲ型超敏反应的发生。IFN-γ抑制TH细胞的增殖和产生 IL-4、IL-10等细胞因子，这种抑制作用能改变免疫反应的类型和产生抗体的类型。IFN-γ能诱导人 B 细胞的增殖和分化，与IL-2 协同增加轻链合成，IFN-γ对B细胞的促增殖作用可能由其他因素介导，因为完全纯化的B细胞对IFN-γ无反应。IFN-γ能够显著增加病毒感染细胞和抗原递呈细胞表达MHCII型分子产生的能力。IFN-γ可诱导单核细胞、巨嗜细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞等MHC II类抗原的识别过程;IFN-γ可使静止的CD4+T细胞分化为Th1细胞,并抑制Th2细胞的增殖,可促进CD8+CLT的成熟及杀伤活性; IFN-C可作用于B细胞,促使其增殖分化,产生抗体,并诱导IgG2a和IgG3的类型转换；

2.4 抗肿瘤作用及作用机理

实验表明,在体内外干扰素都能够控制肿瘤生长,抑制肿瘤复发和转移[13]。在3类干扰素中,抗肿瘤作用以IFN-γ最强。干扰素抗肿瘤主要表现在：第一，抑制肿瘤的增殖，但需连

图2.4.1 IFN抗肿瘤作用机理示意图

Fig2.4.1 Schematic diagram of IFN anti-tumor effect

续使用干扰素，才能显示抑瘤效果；有些肿瘤的发生与病毒有关,这些病毒的核酸往往需要整合到细胞的DNA中去,形成病毒基因,这些基因持续存在是肿瘤的发生原因之一。由于IFN的抑制作用,感染病毒的量明显减少,这样就可防止新细胞受病毒侵犯而转化成肿瘤细胞。第二，抑制肿瘤细胞的增生,干扰素作用于细胞膜,刺激腺苷酸环化酶,使cAMP增加,抑制DNA的合成及细胞分裂,故有抗肿瘤作用；第三，调动机体免疫系统,提高机体抗瘤免疫力。研究者已将 IFN-γ 基因借助逆转录病毒载体转移入肿瘤细胞，使肿瘤细胞自行分泌IFN-γ，发挥杀瘤效应。IFN能增强巨噬细胞及NK细胞的杀伤性,增加细胞表面抗原和受体的表达,抑制B细胞的功能,从而降低肿瘤细胞表面封闭抗体的水平。第四，干扰素能改变瘤细胞表面性能,诱发新的抗原,从而易被免疫监视细胞识别并加以排斥。

3. 干扰素的基本特性

3.1一般特性

干扰素可在多种诱导剂的诱导下产生,用植物凝集素(PHA)、病毒等作为诱导剂,均可利用半数细胞病变抑制法(CPEI50)测到诱导生成的干扰素活性[14]。项黎新等还用草鱼出血病病毒(GCHV)体外诱导草鱼白细胞产生干扰素。干扰素的分子质量一般为20 ku~100 ku,不能透过普通透析膜,但可通过滤菌器,干扰素比病毒颗粒小,能沉淀病毒的离心力不能沉降干扰素[15]。干扰素一般在56℃下30 min不会被灭活, -20℃下可长期保存。Ⅰ型干扰素具有耐酸性,在pH 2.0~10.0条件下很稳定。Ⅱ型干扰素不耐酸,也不耐热,在pH 2时不稳定,在56℃下30 min会被破坏。干扰素一般由130个~170个氨基酸组成,含17种以上的氨基酸,其中的天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量较高,不含核酸,所以不被DNA酶或RNA酶破坏,但易被胰蛋白酶、乙醚、氯仿、酮基等破坏。

干扰素具有广谱性，即干扰素作用于机体有机组织细胞后，可使其获得抗多种病毒和微生物的能力。但干扰素仅作用于异常细胞，对正常细胞的作用很小，也就是说，干扰素对一个体细胞来说又有严格的选择性，而且有相对的种属特异性，即由某一种生物细胞产生的干扰素 只作用于同种生物细胞，使其获得保护力[16]。对其他种生物细胞则无作用，因而其应用受到限制。

3.2 干扰素的分子结构和基因

IFN-α和IFN-β基因位于人9号染色体和小鼠4号染色体上,并连锁在一起,而人和小鼠IFN-γ基因分别定位于12号和10号染色体[17]。在DNA水平上,IFN-γ基因与IFN-α/β基因无同源性,而人和小鼠的IFN-γ有65%左右同源性。

IFN-α有多种亚型,各亚型均含165~166个氨基酸残基,结构相似。IFN-α1型分子中含有5个半胱氨酸的残基,形成2对二硫键,分别为Cys1-Cys98和Cys29-Cys138。第85位上半胱氨酸的巯基游离。IFN-α2型分子在第85位不是半胱氨酸,而是酪氨酸,它所形成的二硫键与IFN-α1型完全相同。IFN-α活性形式为单体,尽管一些干扰素在翻译后进行N-糖苷键型和O-糖苷键型糖基化修饰,但大多数亚型都没有糖基化。目前已鉴定出的IFN-α非等位基因至少有15个; IFN-β由单基因编码,含166个氨基酸残基。IFN-β分子中含有3个半胱氨酸残基,其中能形成二硫键的是Cys31-Cys141,它与IFN-α的Cys29-Cys138结构同源。第17位的半胱氨酸巯基游离。IFN-γ也是由单基因编码的,其天然活性形式是N-糖基化的同源二聚体。IFN-C有不同于Ⅰ型干扰素的细胞表面结合受体[17]。IFN-γ不含半胱氨酸,在第25位和第97位的Asn处有两个N糖基化位点。此外,还有来源于白细胞的IFN-X, IFN-X含172~174个基酸残基。不同类型IFN分子具有不同程度的氨基酸同源性(IFN-α与IFN-β分子同源性为28%,与IFN-X分子同源性高达60% )。IFN-α与IFN-β的结构基因均定位于人的第9号染色体上,而且都不含有内含子, IFN-γ基因定位于第12号染色体上,共含有3个内含子。动物IFN-γ基因4个外显子编码数目相近的氨基酸,第一个外显子包含5.UTR编码19个氨基酸的信号肽序列和22个氨基酸的成熟蛋白质;外显子2、3、4分别编码23、60、40个氨基酸,外显子4包含终止子与3.UTR,外显子2与4编码的氨基酸序列具有高度保守性,分别为56. 5%与42. 5%。3个内含子准确插入两个密码子之间的开放阅读框。内含子都具有保守性序列,包括5,GT与3,AG。尽管氨基酸序列存在差异,但I型干扰素具有相似的三维结构,都由紧密排列的α螺旋结构域构成,并表现出相似的生理生化特征,如对pH值的稳定性和对同类细胞表面受体的识别相似[18]。

4. 干扰素的基因工程

随着基因工程技术的发展, 20世纪70年代,科学家开始探索干扰素的基因工程生产方法。国际上最先克隆的干扰素为IFN-β,由日本的Taniguchi等于1979年完成的。研究表明,通过工程化大肠杆菌、酵母及真核细胞(如CHO等系统)表达的重组干扰素具有与天然干扰素高度相似的生物学活性,且纯度更高、性能更均一。美国食品药品管理局(FDA) 1986年首先批准IFN-αIIa和IFN-αIIb干扰素投放市场,基因工程IFN-β、IFN-γ也相继于1990、1993年获准投放市场。

我国基因工程干扰素的研制工作是由侯云德教授首先开始的,他于1982年建立了无性繁殖系统,并于1985年成功表达出干扰素。随后我国科学家于1989年又成功研制出中国人基因克隆和表达的基因工程药物-基因工程IFN-αlb型干扰素,并于1992年获得国家一类新药证书。此后,人的多种干扰素不断得到克隆与表达,并在临床医学上得到广泛应用。近年来,随着新型载体的不断开发,兽用基因工程干扰素得到深入研究,如陈涛等[19]用巨引物PCR法介导的定点突变将其克隆的猪IFN-A第86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC),将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变为大肠杆菌偏爱的密码子TGC,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX-IFN,表达了猪IFN-α;谢海燕等[20-21]也克隆了猪IFN-α基因,构建了原核表达载体,成功地表达了猪IFN-α;葛丽等[22]克隆了猪IFN-A,构建了真核表达载体,并成功地表达了猪IFN-α;曹瑞兵等[23]克隆并改造了猪IFN-α1基因,实现了在原核系统中的高效表达;黄志清等[24]则实现了猪IFN-γ基因在真核表达载体中的表达。这些研究为重组干扰素用作新型广谱抗病毒生物制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。

图4.1 注射用重组人干扰素α2a

Fig4.1 Recombinant human interferon α 2a

5. 干扰素的临床应用

由于干扰素具有较强的抗病毒、抗肿瘤和参与免疫调节作用,因此干扰素在人类临床医学中得到了广泛应用。临床证明, IFN类药物中, IFN-α2a和IFN-α2b的再次给药可提高疗效,正在进行治疗慢性非活动性肝炎、亚急性硬化症脑炎、人T细胞白血病病毒骨髓症等适应症的研究。IFN-γ可激活Th1细胞以促进细胞免疫功能,针对免疫原性弱的癌细胞可激活细胞免疫应答。针对癌症、艾滋病、丙型肝炎抗感染治疗药的开发[25],IFN-γ的研究有可能使其成为治疗慢性风湿性关节炎、慢性肉芽肿的药物,也有可能成为对现有抗癌药无效的肿瘤的治疗药物。而且IFN是唯一一个被FDA批准治疗慢性丙型肝炎的药品。病毒唑联合IFN-A治疗丙型肝炎,对于40%慢性丙型肝炎患者具有不同程度的疗效。新开发的一种药物聚乙二醇干扰素,由于其独特的药动学特点,在机体内耐受性要优于普通干扰素[26],临床试验中显示出比普通干扰素更好的疗效。因此,聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎被证明是目前的最佳疗法[27-28]。利用IFN-γ对细胞因子网络所发挥的重要作用,即通过抑制IL-24而降低IgE的产生,IFN-γ也可能成为全新的抗过敏药[29]。由于干扰素可以降低SARS病毒在肺部的含量,干扰SARS病毒的增殖,也可用于SARS的治疗。而在人的Caco2细胞(人的结肠癌细胞)和Vero细胞中,Ⅱ型IFN-γ和Ⅰ型干扰素((IFN-α,IFN-β)对SARS-CoV具有较好的抗病毒活性[30]。用病毒唑与IFN-β联合给药能够抑制病毒的增殖,其中病毒唑的使用量减少至单独使用量的1/10;IFN-β浓度降低了50倍~2 000倍,免疫抑制治疗实验数据显示较高的协同抗病毒作用。结合治疗的方法不仅减少了单个剂量的用量,而且在早期的SARS治疗阶段中效果明显,可有效地抑制病毒复制,阻止了免疫病理损伤。此外,干扰素还应用于生殖道衣原体感染、浅表膀胱癌、尖锐湿疣、皮肤病、血液系统疾病、艾滋病相关综合征等的治疗。世界上已有许多国家批准生产使用重组干扰素制剂,用于治疗多种疾病。经过临床应用治疗表明,用干扰素治疗,一般无严重副反应,少数病例可有发热、疲劳不适、食欲不佳、白细胞减少以及血压波动等症状,但停药后会很快消失。

6. 干扰素的研究进展及市场前景

为了将干扰素用于临床实际,经过了几十年不间断的努力,先后经历了干扰素诱导物研究、干扰素作用介质的研究和干扰素血液制品的研究三个阶段,依旧没有解决干扰素的临床需要问题。直到20世纪70年代开始探索用基因工程的方法生产干扰素,改造干扰素及其表达系统,取得了很大进步。1980年Derynck等克隆了人干扰素基因,1981年Goeddel报道干扰素-γ基因克隆成功, 1982年Deuager等根据人干扰素氨基酸序列,首先人工合成了干扰素基因,并克隆成功。我国于1982年从新城疫病毒(NDV)诱生的脐带血白细胞中提取干扰素mRNA,经反转录合成cDNA,也建立了人干扰素基因无性繁殖系,并产生了重组干扰素[31]。十多年的临床应用研究结果表明,干扰素活性的发挥受微细基因组的调控,与机体内许多RNA及蛋白质的合成有关。1986年,美国食品药品管理局( FDA)首先批准α2a和α2b干扰素投放市场,基因工程β、γ干扰素也相继于1990年、1993年获准投放市场。已有57个国家批准干扰素上市,治疗约30多种疾病。国内研制开发的人αⅠa、αⅡb基因工程干扰素已经投放市场,其中人工αⅠb型基因工程干扰素属我国首创。基因工程载体技术的研究和应用也促进了干扰素的研究与开发。人干扰素-β基因在烟草中表达成功、新型载体不断构建成功、新的亚型干扰素基因陆续被克隆、测序和表达。例如,构建了新型双顺反子表达载体PEC34和人干扰素-γ植物双元表达载体;克隆和测序了猪干扰素-β基因和肉鸡干扰素-α基因,并将后者在大肠埃希菌中进行了表达；克隆和鉴定了鸡干扰素-γ基因,为进一步研究该基因的功能及其在控制家禽传染病方面的应用奠定了一定基础。

随着人们对干扰素研究的不断深入,尤其是现代分子生物学飞速发展,人们对干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理的不断阐明,使得人们在干扰素领域取得了空前的进步。在未来的临床研究中,干扰素独特、多样的生物学效应是开发这种细胞因子治疗优势的基本点,将干扰素与癌症疫苗或病毒疫苗结合使用,通过选择合适的剂量和给药方法,可能是在机体内产生最佳的和持久的抗癌应答及抗病毒应答的重要途径。

干扰素适应症广泛，已获批准的适应症临床应用疗效确切，目前尚无哪种新药可以取代干扰素。根据新药开发研制周期的特点，至少未来3~5年内国内干扰素的市场不会受到大的冲击，甚至会不断增长。2000年全国干扰素市场销售额接近10亿元人民币。1997年以前国内重组干扰素市场主要由进口产品独霸天下，97年以后国产重组干扰素先后问世，当时干扰素年销量不过亿元，短短5年时间，销量翻了几翻，而且价格也不断下调到比较符合中国老百姓目前的承受水平，在市场竞争中占有明显的价格优势，使进口产品市场不断减少，国产干扰素成为市场的主导。尽管我国面临加入WTO后给干扰素带来的挑战与冲击，但干扰素以其质量高，疗效稳定，价格低，两种注射剂型的优势，一定能打出独特的国内干扰素品牌效应，赢得市场，赢得民心。
目前国内生产总值以每年7%的速度发展，而医药工业每年以10-15%的速度增长。生物制药业年产值最多仅相当于医药工业产值的2%，但增长速度很快。随着人口的增长和生活水平的提高，对医药的需求不断增加，卫生部1997年的统计数字表明，每年平均每一住院患者住院医疗费增长31%，其中药费占50%。未来3-5年应重视农村市场的开发，这是不容忽视的战略重点，农村人口多，地域广，市场容量大，投入产出比值大，渴望能成为新的增长点。

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本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/20e617c7b9d528ea81c779f4.html