抗HBs mAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异 HBsAg的交叉反应特征（一）

发布时间：2019-01-23 16:01:29 来源：文档文库

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抗HBs mAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异 HBsAg的交叉反应特征(一)

作者：李方和,张小燕,严兵△,张波,黄永国,张春燕,龚劲松,陈妍,刘静华

【摘要】目的:抗HBsG6mAb制备及其对重组野生与免疫逃逸变异HBsAg结合能力与特点的评价。方法:常规制备并纯化抗HBsmAb,以纯化抗HBsmAbIgG包被,采用ELISA对17种野生及“a”决定簇替代性变异全基因重组表达HBsAg进行检测,并与几种市售HBsAg检测试剂进行比较。结果:该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定,其培养上清与腹水效价分别为2048及4096×103;对野生HBsAg检测（ELISA）敏感性不低于0.125μg/L。该抗体可与15种变异抗原中12种发生反应（P/N≥2.5）,反应信号强度分别为低反应组（2份,与野生株A值比较,下同）平均7.55%;中反应组（1例）为59.40%;高反应组（9种）分别为野生株的92.1%～109.4%,低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在HBV“a”决定簇I环的起始部即120～124序列之间。部分表达产物采用市售试剂作同步检测,平均显色强度高于或明显高于几种国内应用最为普遍的HBsAgELISA（P0.05)。结论:抗HBsG6mAb对多数免疫逃逸变异HBsAg有很强的结合能力,所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律。

【关键词】乙型肝炎病毒基因变异HBsAg免疫逃逸ELISA

Abstract]AIM:TopreparemonoclonalantibodiesagainstHBsAgandestimateitsbindingcapacitytobothwild typeandvariesofimmuneescapemutant typeHBsAg.METHODS:Usingself madetheanti HBsG6mAbandHRP labeledgoatanti HBsantibody,AsandwichELISAfordetectionbothwild typeandvariesofimmuneescapemutant typeHBsAghasbeendeveloped.Applyingthisassay,todetect17speciesofwholegenewild typeandrecombinationexpressedHBsAgwhichvariedin“a”determinant.toevaluateitsclinicalapplicationcharacteristicofthisassay,weusedtheothercommercialreagentstoComparingwithit.RESULTS:Onestrainhybridomacelllinsecretedanti HBsmAb(definedG6),wasobtained.Itgrewstablyandthetitersoftheculturesupernatantandhydroperitoneumwere2048and4096×103.Thesensitivitytothewild typeHBsAgofthisassaywaslessthan0.125μg/L.Thisanti HBsmAbcanbindwith12in15speciesmutantHBsAg(P/N≥2.5),and2ofthemwerelowabsorbentvalueat450nm(A450)groupwhichwas7.55percentofthewild type,1ofthemwasmiddleA450valuegroupwhichwas59.40percentofthewild type,9ofthemwerehighA450valuegroupwhichwas92.1-109.4percentofthewild type.ThelowA450valuegroupandthenegativegroupwerediversifiedin120-124basylinIloopoftheHBV“a”determinant.Wealsousedothercommercialreagents,whichwaswidelyusedinclinic,todetectpartialspeciesmutantHBsAg,theaverageA450valuewaslessthanforegoingassay.CONCLUSION:TheG6anti HBsmAbwasabletobindmostoftheimmuneescapemutantHBsAginthetest.AndtherewouldbesomespecialregulationsbetweenthemutantsiteandtherecombinationexpressedHBsAgbindingcapability.

Keywords]HBV;genevariation;HBsAg;immuneescape;ELISA

乙型肝炎病毒感染流行范围广,感染人数多,是目前全球最为严重的公共卫生问题之一。该病毒的DNA多聚酶缺乏校对功能,较其他病毒更易形成遗传变异,一旦变异发生在某些特定基因区段（如S基因“a”决定簇）,即可引起所表达蛋白（HBsAg）的抗原性发生漂移或明显漂移,从而形成HBV免疫逃逸变异株（hepatitisBvirusimmuneescapemutantstrain,HBVIEMS）。由于这类变异病毒在体内不能为针对野生HBV的保护性免疫中和,在体外其HBsAg不能为多数现行市售试剂所检出,其存在势必造成部分HBV感染者临床诊断困惑,献血员筛查漏检,及其血清流行病学调查失真,已受到国内外学者的广泛关注2,3]。作者所在单位自上世纪末即高度关注这一现象,并为此进行大量的研究。新近又获得一株能与多数免疫逃逸变异（IEM）HBsAg有极强结合能力的单克隆抗体（细胞克隆序号G6B3F1,分泌物简称抗HBsG6mAb）,并对其与HBV“a”决定簇变异重组表达产物的结合特征进行了初步的评价。

1材料和方法

1.1材料BALB/c小鼠由湖北省疾病预防控制中心动物室提供;HBVDane颗粒、全基因重组野生HBsAg及Al(OH)3凝胶由卫生部武汉生物制品研究所提供;Sp2/0细胞由中国典型培养物保藏中心提供;RPMI1640培养基购自Gibco公司;PEG、HAT、HT以及鼠免疫球蛋白亚类检测试剂等购自Sigma公司;羊抗鼠IgG及HRP标记的羊抗鼠IgG购自美国Pierce公司;HRP标记羊抗HBs、部分HBsAgELISA试剂盒自市售获得;抗HBsA11mAb与抗HBsMtmAb由中科院武汉病毒研究所提供;乙肝病毒G145R变异表面抗原由本室既往制备;其他多种野生与IEM重组全基因S蛋白表达产物（表1）由本院临床免疫研究室收集并提供。

1.2方法

1.2.1抗HBsG6mAb的制备按文献报道4]。常规免疫小鼠,融合及有限稀释法制备杂交瘤细胞;降植烷诱导法制备腹水;采用紫外比色（以BSA为标准）测定腹水中总蛋白含量。抗HBsG6mAbIgG的纯化采用辛酸硫酸铵沉淀法。

1.2.2G6 ELISA的建立采用纯化抗HBsG6mAbIgG包被,羊抗HBs HRP示踪,建立双抗体夹心ELISA。主要操作为(1)将抗HBsG6mAbIgG以pH9.6的碳酸缓冲液稀释,加入酶标反应板各孔中,4℃放置过夜;（2）以PBST洗涤5次,加入20g/LBSA（150μL/孔）,置37℃2h,甩干;（3）加入待测或对照标本（100μL/孔）,37℃反应30min;（4）同上洗板,每孔加入100μL羊抗HBs HRP,37℃反应30min;（5）同上洗板,加入TMB H2O溶液显色15min,以2mol/LH2SO4终止反应,置酶标仪上测定A450值,以P/N≥2.1判为阳性。

1.2.3阻断试验在上述G6m ELISA的基础上进行,主要操作为MTmAb或A11mAb包被;包被;加入与不同抗HBsG6mAbIgG预温（30min）后的r wHBsAg或r G145RHBsAg反应;加入HRP标记羊抗HBs反应;加入TMB H2O溶液显色,同上测定A450值,并与未中和孔比较计算实验孔显色抑制百分率。

1.2.4常规HBsAgELISA检测其他多种HBsAgELISA检测参照试剂说明进行。

1.2.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析,结果以P0.05为有统计学意义。

2结果

2.1mAb的制备采用常规细胞融合制备杂交瘤细胞,以间接ELISA对其抗体的特异性与分泌能力进行筛选,经3次克隆化（有限稀释法）后获得能高效分泌抗HBsIgG6mAb的G6B3F1杂交瘤细胞系。以降植烷诱导法制备腹水,并以辛酸硫酸铵沉淀法纯化,产物即为抗HBsG6mAbIgG。采用紫外比色及其双抗体夹心ELISA对细胞培养上清、腹水及纯化产物进行检测,杂交瘤上清抗HBs效价为2048,后二者蛋白含量及效价分别为11.2±3.16g/L与4096×103,以及3.6g/L与1024×103。

2.2G6MELISA的敏感性采用G6 ELISA对系列稀释的部颁高浓度HBsAg值控血清进行检测,并与重组G145R变异全基因表达产物（浓缩培养上清）进行比较,实验结果见图1。该抗体与2种不同抗原反应的显色强度大致相当,稀释曲线斜率分别为0.716与0.729;部颁质控血清（自然表达野生HBsAg）稀释至0.125μg/L时仍能得到较强阳性结果（P/N值为4.5）。