潍坊市职业学院项目课程
实验设计
项目名称：
植物的组培快繁
实训地点：
学院组培中心
实验设计者：
王珏（0903199）
09级园林工程系生物技术及应用专业
设计时间：
20**年12月26日—20**年7月9日
指导教师：
丁雪珍
一实验名称：
长寿花的组培快繁
二实验目的：
1、通过对长寿花进行组培快繁从而进一步了解植物组培快繁的原理；
2、熟悉并掌握植物组配快繁的工艺流程；
3、更熟练的掌握组培快繁的多项技术；
4、对植物的组织培养的方法及有关知识拥有更深的了解；
三实验原理
植物的组织培养是指在无菌条件下，将植物的离体器官、组织、细胞以及原生质体，应用人工培养基，创造适宜的培养条件，使其长成完整小植株的过程。
植物的组织培养也就是根据植物细胞的全能性（每个具有完整细胞核的细胞都具有该植物的全部遗传信息和产生完整植物体的能力）利用外植体（从植物体上切取下的根、茎、叶、花、果实、种子、器官以及各种组织和细胞）进行了转接、继代培养以及驯化的过程，虽然此过程投资少、成本低而且历时短但是植物组织培养拥有很多优点。如：
1、研究材料单一，无性系遗传信息相同；进而保证了遗传性状的一致性，避免了误差，实验材料的纯度高，可以减少实验的重复而不影响实验的精度。
2、经济方便，效率高；进行实验时投资少、成本低但是利润高从而节约了人力和物力。
3、培养条件了可控，可周年实验或生产；避免了由于节气带来的影响。
4、生长快，周期短，重复性强；
5、管理方便，利于自动化控制；通过仪器来提供试管苗的培养环境，大大节省了人力、物力及土地，也有利于工厂化生产。
本次实训以植物花月为对象用其幼叶作外植体进行组织培养（无菌短枝型），来领悟植物组织培养的原理。
四实验仪器及其他用具
1、玻璃器具
玻璃棒；烧杯；量筒；三角瓶；试剂瓶；胶头滴管；果酱瓶；酒精灯；漏斗；
2、所需的实验仪器
酒精灯；电子天平；磁力搅拌器；冰箱；超净工作台；接种器具消毒器；立式高压蒸汽灭菌锅；电炉；培养架；空调；
3、实验药剂
蒸馏水；葡萄糖；琼脂粉；MS母液（大量元素、微量元素、铁盐、维生素）；6-BA；2,4-D；IBA；IAAF；活性炭；95%酒精；氯化汞溶液；洗洁精；高锰酸钾；
4、其他用具
纱布；喷壶；搁置架；打火机；弯刀剪；麻线；牛皮纸；封口膜；剪刀；试管刷；洗耳球；引流器；PH试纸；周转箱；胶皮手套；秒表；废空箱子；马铃薯；刀；案板；铁架台；铝锅；麦麸；穴盘等
五设计方案
1、实验研究对象
植物长寿花
拉丁名：winter pot kalanchoe
科属：景天科，蔷薇属
别名：寿星花
原产地：东非马达加斯加岛
长寿花（Kalanchoe blossfeldiana cv tom Thumb） 别名寿星花、假川莲、圣诞伽
1.1植物简介
长寿花是一种多肉植物，由肥大、光亮的叶片形成的低矮株丛终年翠绿。春、夏、秋三季栽植于露地作镶边材料，12月至翌年4月开出鲜艳夺目的花朵。每一花枝上可多达数十朵花，花期长达4个多月，长寿花之名由此而来。长寿花是元旦和春节期间馈赠亲友和长辈的理想盆花。
长寿花为多肉植物，性喜较暖和气温，生长适宜温度以白天不超过30度，晚间温度不低于18度为宜。温度太高，太低会影响其正常生长。长寿花以扦插繁殖为主，温度在20~25度最适合其发根。 长寿花适合排水好的土壤，以泥炭为主加上蛭石、珍珠岩的人工培养土最佳。培养土的ph值最好为5.8~6.2。 长寿花对于水的需求量较低，中午前浇水完毕，入夜之前叶片一定要保持干燥。 短日照植物，处理后至少6周后才会开花。短日照处理时最少每天要有14小时黑夜。一般而言，每年10月1日至第二年3月1日为自然短日期。种在较大花盆中的，生长初期要给予长日照处理，让植物达到一定大小后能给予短日照处理，使其开花。要不然，植株可能会偏小。
1.2生长习性
长寿花原产非洲。喜温暖稍湿润和阳光充足环境。不耐寒，生长适温 度为15～25℃，夏季高温超过30℃，则生长受阻，冬季室内温度需12～15℃。低于5℃，叶片发红，花期推迟。冬春开花期如室温超过24℃，会抑制开花，如温度在15℃左右，长寿花开花不断。
长寿花耐干旱，对土壤要求不严，以肥沃的砂壤土为好。长寿花为短日照植物，对光周期反应比较敏感。生长发育好的植株，给予短日照（每天光照8～9小时）处理3～4周即可出现花蕾开花。
1.3繁殖方法
在5～6月或9～10月进行效果最好。选择稍成熟的肉质茎，剪取5～6厘米长，插于沙床中，浇水后用薄膜盖上，室温在15～20℃，插后15～18天生根，30天能盆栽。常用10厘米盆。如种苗不多时，可用叶片扦插。将健壮充实的叶片从叶柄处剪下，待切口稍干燥后斜插或平放沙床上，保持湿度，约10～15天，可从叶片基部生根，并长出新植株。
1.4光照与温度
长寿花为短日照植物，对光照要求不严，全日照、半日照和散射光照条件下均能生长良好。适宜生长温度15-25℃。夏季炎热时要注意通风、遮荫，避免强阳光直射。冬季入温室或放室内向阳处，温度保持10℃以上，最低温度不能低于5℃，温度低时叶片容易发红。生长发育良好的植株经过短日照处理（每天光照8—9小时，其余时间遮光处理，20 - 30天即可形成花蕾）。
浇水与施肥
长寿花为肉质植物，体内含水分多，比较耐干旱。生长期不可浇水过多，每2-3天浇1次水，盆土以湿润偏于为好。如果盆土过温，易引起根腐烂。浇水掌握“见干见湿、浇则浇透”的原则。冬季应减少浇水，停止施肥。生长期每月施1、2次富含磷的稀薄液肥，施肥在春、秋生长旺季和开花后进行。
2、外植体的选择与处理
1）选择长势、大小、颜色相近，饱满的6片嫩叶和6个带有芽体或顶芽的茎段。
2）在进行外植体消毒灭菌的过程中所需的试剂有：
两个果酱瓶两的无菌水；0.1%氯化汞溶液100mL；75%的酒精；
3）所需的玻璃仪器为：
两个果酱瓶；两个三角瓶（盛装试剂）；三个空三角瓶（盛装外植体）；一个空瓶子（用以盛废液）；
3、外植体的启动培养
分别利用0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的 MS+IBA和1mg/L、2mg/L、3mg/L的 MS+6-BA固体培养基进行启动培养。所需的用品为：三角瓶12个；MS母液500ml；;
4、继代增值培养
分别利用0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L的 MS+IBA和1mg/L、2mg/L、3mg/L的 MS+6-BA固体培养基进行启动培养。所需的用品为：三角瓶12个；MS母液500ml；
5、生根诱导
分别配置200ml的1/2MS+IBA、1/2MS+0.1%-0.2%的活性炭和1/2MS+0.1%-0.2%的活性炭+IBA0.2mg/L固体培养基，在此过程中要用到葡萄糖12g；琼脂4.5g；三角瓶12个；1/2MS母液600ml；
注：
以上三个步骤总需三角瓶44个；果酱瓶3个；封口膜88张；麻线44条；其他实验用具看具体实训状况。
在外植体启动培养、继代转接和生根诱导时每一个外植体对应一个固体培养基。
6、幼苗的驯化移栽
当试管苗长到3-4cm时，洗去幼苗根部的培养基后转移到基质中培养。
我将选择麦麸为基质，以16X8规格的穴盘为栽培场所；在插入幼苗前用0.5%的高锰酸钾进行基质的灭菌。
注：
在外植体启动培养时继代转接以及生根诱导时将瓶苗置于温度为25度左右、湿度在70%-80%之间的环境下培养，并定时观察瓶苗的污染率以及成活率。
在移栽瓶苗后定时观察幼苗的长势、基质中水分含量及幼苗的成活率。
六、具体实施步骤
组培快繁实施方案
内容提要
本方案是长寿花组培快繁设计的具体化，具体描述了外置体的预处理/表面灭菌/启动及增殖/生根/驯化的过程；此外了解到了组培快繁的操作流程/前景以及外界环境对植物生长的必要性。
关键词
长寿花；组培快繁；外植体
烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；移液管；酒精灯；废液缸；罐头瓶；试剂瓶；胶头滴管
超净工作台；电子天平；卧室高压蒸汽灭菌器；接种器具消毒器
大量元素；微量元素；铁盐；肌醇；维生素；蒸馏水；IBA；6-BA；活性炭等
镊子；纱布；吸耳球；封口膜；剪刀；麻线；pH试纸；牛皮纸；麻线；喷壶等
长寿花的叶片及茎段
用剪刀从长势健壮的植物长寿花幼茎上剪取15片大小、颜色大致相同的幼叶及五个带有芽体或顶芽的茎段。
然后将外置体放入一大烧杯中用洗洁精清洗干净，等待无菌操作。
1.2.2.1灭菌前的准备
1、无菌水准备：
让两个洁净空的果酱瓶称装上自来水，盖好瓶盖后等待灭菌（121℃，30min）。
2、三角瓶的洗涤与烘干：
挑选出完好无损的三角瓶15个进行洗涤，晾干后备用。
3、启动培养基的制备：
配置500mlMS固体培养基→每40mL分装到小三角瓶内→往培养基内加放事先计算好的6-BA及IBA的用量→用封口膜、麻线给三角瓶封口包扎→灭菌（121℃，30min）
4、灭菌器材的包扎：
用牛皮纸将纱布、搁置架、三个空三角瓶包扎后以备灭菌（121℃，30min）。
5、灭菌剂的配制：
配制0.1%的氯化汞和75%的酒精溶液各100mL，然后用试剂瓶盛装。
1.2.2.2灭菌
将包扎好的培养基和灭菌器材利用立式高压蒸汽灭菌器进行灭菌（121℃，30min）。
1.2.2.3超净工作台的准备：
接通超净工作台的电源后打开紫外灯→30min后关掉紫外灯再打开风机约20min→随后用肥皂洗手→打开日光灯进行无菌操作，
1.2.2.4无菌操作（即：外植体的表面灭菌）：
把灭好菌的纱布、搁置架、镊子、培养基、空三角瓶及装有70%酒精的喷壶、配好的灭菌剂、酒精灯、打火机、记号笔、秒表、外植体放入一空的周转箱内，然后将周转箱摆放到超净工作台的一侧，另一侧放一空箱子用于盛放灭菌后的牛皮纸。准备就绪后开始操作：
1、拆下纱布并用70%的酒精浸透，拆下的牛皮纸放于空箱子内然后用浸有酒精的纱布擦拭手和超净工作台的台面对其进行消毒。
2、点燃酒精并将灯帽扣于酒精灯一旁（为一旦有火灾发生时便于及时盖死酒精灯）或者在台面的一侧放一块干抹布；然后在酒精灯火焰旁拆开灭过菌的镊子、搁置架等并把拆下的牛皮纸放到空箱内并用浸有酒精的纱布擦拭盛有灭菌剂的果酱瓶及培养基瓶、空三角瓶的瓶壁；最后有次序的摆放好台面上的物品进而进行无菌操作。
3、用灭完菌的镊子将选好的外植体放于空三角瓶内，且每空三角瓶内装入的外植体数目为4-5个。
4、先往三角瓶内倒入适量的0.1%氯化汞溶液，灭菌3min；倒掉灭菌剂后再用75%的酒精进行灭菌，计时60s;最后用无菌水洗涤三次，每次历时1min。清洗干净后等待转接。
注：（每次灭菌时要一边振荡，为的是赶走气泡；一只手拿住外植体的三角瓶进行灭菌两一只手给镊子灭菌，即：在酒精灯火焰的外焰上进行灼烧。）
1.2.2.5外植体的转接：
拆下包扎培养基的麻线，接着用灭过菌的镊子将外植体转接到培养基内（每瓶培养基转接一个外植体）；转接后灭掉酒精灯再包扎培养基；包扎好培养基后用记号笔标记好时间、操作人的名字；最后整理好超净工作台的台面，接着用周转箱将其置于培养架上培养。
注（在打开和包扎培养基时都要在酒精灯火焰处灼烧瓶颈，给其灭菌；在给镊子后待镊子的温度冷却后再进行转接，避免温度过高烫伤外植体。）
1.2.2.6培养：
将瓶苗置于18-21摄氏度的培养室内进行培养。
外置体转接情况
第一次转接培养5天后大部分叶片及茎段呈褐色。
呈红褐色的叶片及茎段
分析：
可能是由于进行外置体表面面灭菌时灭菌时间太长导致的。
第二次转接培养时的状态如图所示：
七、实验心得与体会
从实验设计到真正实施方案，我从中学会了查阅资料及分析资料的方法，从而定制出长寿花的组培快繁的方案。
此外亲身体会到了组培快繁技术的广泛性和严谨性；从第一次外置体转接培养失败试验中得知外置体处理方法的专一性（即：每一种植物的外置体进行表面灭菌的时间都是一定的）和培养条件的专一性。
八、附录：
1、MS培养基的配方
2、各种植物激素的简介及对植物生长的影响
人工合成的具有生理活性、类似植物激素的化合物称为植物生长调节剂，或植物外源激素。它们少量施加即可有效地控制植物的生长发育，增加农作物产量，在农业和园艺上得到广泛应用。这些植物生长调节剂有以下几类。
1.生长促进剂。为人工合成的类似生长素、赤霉素、细胞分裂素类物质。能促进细胞分裂和伸长，新器官的分化和形成，防止果实脱落。它们包括：2,4-D、吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2,4,5-T、2,4,5-TP、胺甲萘（西维因）、增产灵、GA3赤霉素、激动素、6-BA、PBA、玉米素等。
2.生长延缓剂。为抑制茎顶端下部区域的细胞分裂和伸长生长，使生长速率减慢的化合物。导致植物体节间缩短，诱导矮化、促进开花，但对叶子大小、叶片数目、节的数目和顶端优势相对没有影响。生长延缓剂主要起阻止赤霉素生物合成的作用。这些物质包括：矮壮素（CCC）、B9（比久）、阿莫-1618、氯化膦-D（福斯方-D）、助壮素（调节安）等。
3. 生长抑制剂。与生长延缓剂不同，主要抑制顶端分生组织中的细胞分裂，造成顶端优势丧失，使侧枝增加，叶片缩小。它不能被赤霉素所逆转。这类物质有：MH（抑芽丹）、二凯古拉酸、TIBA（三碘苯甲酸）、氯甲丹（整形素）、增甘膦等。
4.乙烯释放剂。人工合成的释放乙烯的化合物，可催促果实成熟。乙烯利是最为广泛应用的一种。乙烯利在pH值为4以下是稳定的，当植物体内pH值达5~6时，它慢慢降解，释放出乙烯气体。
5.脱叶剂。脱叶剂可引起乙烯的释放，使叶片衰老脱落。其主要物质有三丁三硫代丁酸酯、氰氨钙、草多索、氨基三唑等。脱叶剂常为除草剂。
6.干燥剂。干燥剂通过受损的细胞壁使水分急剧丧失，促成细胞死亡。它在本质上是接触型除草剂。主要有百草枯、杀草丹、草多索、五氯苯酚等。
使用植物生长调节剂虽然可以调节植物生长，但滥用激素往往造成无法弥补的产量损失，因此使用浓度一定要适当，使用次数一定不能过多。
例如：
1)IBA--吲哚丁酸，也是生长素的一种，可以促进生根，尤其是不定根的生长。
2)6-BA是6-苄氨基嘌呤，是细胞分裂素的一种，促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织的发生，促进非分化组织分化，防止老化等功能。
3)IAA—吲哚乙酸；促进细胞的延伸生长和细胞壁结构的松弛，进而从促进生根和愈伤组织组织的形成。
附加：
活性炭在组织培养中的应用：
在植物组织培养生根过程中,活性炭(AC)可提供生根的暗环境,防止褐变,提高培养体内可溶性蛋白和总糖的含量,吸附植物生长调节剂与其他有利生根的物质,应选择合适的活性炭浓度,利于生根的适宜浓度为0.1%～0.5%。
1．促进芽的增殖、茎和苗的生长。
在茎尖培养和茎段培养时，为防止褐变和有害物质的积累,常在培养基中加入适量活性炭。汤浩等研究表明，果蔗茎尖培养时培养基中加入0.05%的活性炭对防止培养基褐变有良好的效果，有利芽的诱导和增殖。在防止褐变方面，王敬驹等研究表明，活性炭的防褐效果优于Vc和半胱氨酸。黄霞等在香蕉茎尖培养时也发现，活性炭可改善外植体褐变情况，而Vc不仅不能改善外植体褐变情况，反而使其褐化程度加深。但当Vc与活性炭配合使用时，其合适的浓度组合却比只使用相同浓度的活性炭时更能改善外植体褐变情况。
在库拉索芦荟芽增殖培养中发现，将消毒嫩茎接种于附加不同糖、生长调节剂和活性炭的培养基，当活性炭为0.3%时，平均增殖芽30个；当活性炭为0.5%时，平均增殖芽41个。活性炭对葡萄试管苗的生长有促进作用，不仅表现在株高和叶片数上，而且其植株也比对照生长健壮、叶色深绿。唐菖蒲培养中，在成苗培养基上添加0.2～1.0%的活性炭，对提高成苗率和提高大苗的百分比有着显著的效果，且在此范围内活性炭的用量与其促进效果成正相关。活性炭还可促进中国水仙、百合、大花蕙兰小球茎，马铃薯微型薯的形成，加快繁殖速度。但邢世岩等（1989）认为活性炭对苦楝和臭椿的丛生芽及嫩茎的诱导有抑制作用。
韩文璞等（20**）在甜樱桃组织培养培养中发现甜樱桃组织培养时，在培养基中加入250mg/L的活性碳，生长表现最好，试管苗增殖5.1倍，苗高4.5cm；活性炭为500mg/L时，增殖4.3倍，苗高3.6cm；当活性炭浓度增至750～1000mg/L时，增殖效果明显下降并受到抑制。可见在适宜的浓度范围内，活性炭对试管苗的生长有促进作用，而高浓度时，则起抑制作用。
2．用于生根培养基
活性炭最广泛的应用是用于培养物的生根。一般认为活性炭创造的黑暗环境有利于根的诱导和根系的生长。在甜樱桃组织培养中，添加500～1000mg/L活性炭生根率为95.7%～100%，添加20**～4000mg/L活性炭时，生根率大幅度下降，茎的木质化程度也随浓度的增加而增加。不加活性炭的试管苗根系愈伤化加重，根的组织疏松并褐化，需降低生长素浓度。加入活性炭培养的生根苗移栽成活率均高于对照，且随浓度的增加（1000～4000mg/L）成活率由92.6%提高到100%，移栽后6天即产生次生根，茎叶开始生长，而对照的生根苗成活率仅46.3%。但王乔春（1991）在梨生根培养基中加入活性炭不仅不能促进生根，反而显著的抑制生根，主要原因可能是活性炭吸附了培养基中的生长素。
刘用生等（1997）在苹果试管苗生根中发现，在培养基中仅含0.5mg/LNAA时，新稍基部产生愈伤组织，没有生根；在0.05%活性炭存在条件下，0.5mg/L和3mg/LNAA均未能表现作用，与仅含0.05%活性炭处理相似，附加5.5mg/LNAA能表现一定作用，8mg/LNAA效果较佳。这表明活性炭吸附生长素，但生长素浓度大时，被吸附后还有一定剩余，与活性炭同时发挥作用。甜柿试管苗生根困难，添加活性炭有利于其生根，且根健壮，移栽易成活，这可能与活性炭能够提供暗环境和对培养基中的代谢有害物质的吸收的双重效应有关。另外在葡萄试管苗生根中，添加活性炭根生长加快，而且质地柔韧不易折断，对照的根虽，稍多些，但粗短质脆。
3．用于胚培养，促进成苗
在许多植物的胚培养时，也用到了活性炭。甜柿含酚类物质较多，组培时褐变严重，从而增加了胚培养的难度，需添加抗氧化剂，艾鹏飞（20**）等研究发现，活性炭抗褐化效果比柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮效果都好。Cain等在培养葡萄胚珠时也发现，培养基中加入0.1%活性炭可减轻组织变褐和培养基变色，并产生较少愈伤组织，而不加活性炭则组织变褐，并因产生愈伤组织过多而最终死亡。朱际君等（1983）在培养基中加入活性炭能促进早熟桃萌发成正常苗，且促进根系生长，幼苗健壮，提高了试管苗的质量。
核果类果树的一些品种，特别是早熟品种的胚往往发育不全，在胚培过程中，一般需经过2-3个月的低温处理（1-40C），才能打破休眠。近年来一些研究表明，在培养基中加入GA或BA可代替低温打破休眠。早熟杏胚培养中，活性炭存在情况下，打破休眠所需BA的浓度大幅度提高。在培养基中活性炭为0.02%时，10mg/LBA和5mg/LIAA配合效果最好，成苗率达到83.3%，与对照相比，幼苗健壮，根系发达；在培养基中活性炭为0.05%时，上述激素组合，成苗率仅为25%，与20mg/LBA和5mg/LIAA配合成苗率达50%，苗高与0.02%活性炭与10mg/LBA和5mg/LIAA组合无显著差异，但根长显著高于后者。刘用生等发现，无活性炭时仅需0.5mg/LBA即可有效打破杏和苹果胚的休眠，而在加有200mg/L活性炭的桃幼胚培养基中则需要10mg/L的BA才能打破休眠。
4．用于花药培养
花药培养的主要目的是诱导花粉发育成单倍体，可以快速地获得纯系，缩短育种周期。但实践表明，小孢子的启动发育对药壁组织有相当大的依赖关系。目前对小孢子启动和进一步发育的机理和条件了解不多，花粉培养难度较大。活性炭用于花药培养用于是Nakamura等首先提出的。目前，已经在油菜、马铃薯、烟草、玉米、黑麦、小黑麦、龙眼、辣椒、甜椒和水稻的花药培养中得到应用。
九、参考文献
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/f30adc8e900ef12d2af90242a8956bec0975a5a8.html
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