菊花的组织培养

菊花的组织培养

一、实验目的：

1. 了解植物组织培养技术在生产中的应用。

2. 熟悉植物组织培养的基本过程。

3. 了解影响组织培养的各种因素。

4. 掌握培养基制备，外植体消毒、接种、培养、移栽及培养等基本操作技术。

二、实验原理：

在无菌条件下，利用人工制备的培养基培养植物的离体器官，使其脱分化和再分化，最终诱导外植体发育成为完整的植株。

三、仪器、用具：

超净工作台、光照培养箱、高压锅、电子天平、烘箱、三角瓶、酒精灯、剪刀、药匙、漏斗、玻璃棒、镊子、封口膜、无菌吸水纸、培养皿、量筒、pH试纸、植物组织培养试剂包(购自川布兰公司)。

四、实验材料与试剂：

菊花茎段、蔗糖、琼脂。母液：大量元素(10×)、微量元素(100×)、有机物(100×)、铁盐(200×)、NAA(0.1mg/mL)、IAA(0.1mg/mL)、升汞(0.1 %)、酒精(70%).

配制母液的注意事项：⑴勿用自来水或河水制母液；⑵配制大量元素和微量元素母液时，应将每种化合物单独溶解，再混合，同时清洗烧杯内壁，将清洗后的蒸馏水倒入混合溶液，混合时要按附表中顺序进行，这样可避免发生沉淀；⑶配制好的母液要先倒入1 000ml烧杯，再由烧杯转入1 000ml细口瓶；⑷注意观察母液中是否有絮状物，出现絮状物表明离子间发生反应，需重新配制母液；⑸植物生长调节剂难溶于水，需要碱或酸助溶，生长素类物质用碱（0.1mol/LNaOH1～3ml）或酒精（75～95％的酒精1～3ml）助溶，细胞分裂素类物质用酸（0.1mol/LHCL1～3ml）助溶，也可用水浴法助溶；⑹用棕色细口瓶盛装有机物母液和植物生长调节剂母液，避免透射光损害母液中有机成分；⑺在瓶壁上贴好标签；⑻将配制好的母液放入冰箱中或阴凉处保存。

五、步骤（方法一）：

1. 取称好的10g琼脂加入800ml蒸馏水中，融化后，加入30g蔗糖，加大量元素母液100ml，并依次加入：微量元素10ml、铁盐5ml、有机物10ml、蒸馏水75ml、BA5 ml，NAA 5ml。调节pH到5.8左右，分装到锥形瓶中，每瓶50-100ml，封口。

2. 将分装好的培养基、蒸馏水、吸水纸、培养皿放到高压灭菌锅中，121℃灭菌15min。

3. 外植体消毒：菊花茎段用流水冲洗20min，用75%浸泡的棉球擦拭手及工作台，点酒精灯。在无菌环境下，用无菌吸水纸吸收外植体表面水分。再将其放入70%的酒精中，摇动3-6次，持续6-7秒。取出，在无菌水中清洗，用无菌吸水纸吸干外植体水分，将外植体放入0.1%HgCl中1—2min后，用蒸馏水冲洗至少3次。

4. 将消毒的菊花茎段在无菌培养皿用无菌手术刀(剪)中切成小段，长约0.5—1cm。用镊子夹取菊花茎段插入培养基中(不要倒插)。锥形瓶放在培养架上，温度18-22℃，光照12h，20-30d后，生成愈伤组织。

5. 配置丛芽培养基：在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度分别为2-3mg/L和0.02-0.3 mg/L。无菌条件下，将愈伤组织转接到丛芽培养基上，于培养架上继续培养，10-20d后，愈伤组织长出苗。

6. 配置生根培养基：MS培养基各成分用量减半，并添加NAA或IAA，质量浓度为0.1mg/L。无菌条件下，将培养的菊花转接到生根培养基上，继续放在培养架上培养。10-20d后，生根，用流水冲洗根部培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生长一段时间。移栽后，适时浇水、施肥，直至开花。

五、试剂制备及步骤（方法二）：

1、生芽培养基: 称取1.68gMS干粉（1/2蔗糖、不含琼脂）加入烧杯中, 加入蒸馏水40mL, 加热煮沸, 然后加入6-BA( 1mg/mL) 100微升、NAA( 0.5mg/mL) 8微升, 用10%NaOH调节pH值至6.0, 然后分装至3个三角瓶中, 每瓶约20mL培养基。

生根培养基: 称取2.52gMS干粉加入烧杯中, 加入蒸馏水60mL, 加热煮沸, 然后加入NAA( 0.5mg/mL) 12微升, 用10%NaOH调节pH值至6.0, 然后分装至3个三角瓶中, 每瓶约20mL培养基。

2、实验步骤：

（1）将分装好的培养基和接种需要的器械用高压锅进行灭菌。灭菌后剪刀、镊子放入超净台中，培养皿放入烘箱烘干。

（2）无菌室定期用紫外灯灭菌，超净工作台接种前30min打开紫外灯，洗净双手；点燃酒精灯，再用75%的酒精消毒双手，用酒精灯灼烧镊子和剪刀灭菌，准备接种。

（3）取出菊花无菌苗，放在培养皿中，切去菊花的叶片，将茎切成0.5-1.0cm2大小的节段；然后将茎段的下部竖直插入生芽培养基中，培养基外部至少留1个叶柄，最后用封口膜将三角瓶封好，放入光照培养箱中诱导生芽。光照每天12h，温度设定在25℃。

（4）取无菌苗的上部作为外植体，插入生根培养基中，诱导产生根，将组培苗放入光照培养箱中，一天光照12h， 在25℃的环境中进行培养。

3、MS培养基母液的配制：

表1 MS培养基母液的配制

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/f2a17b62fad6195f312ba6d0.html