杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

发布时间：2018-07-01 03:57:19 来源：文档文库

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杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

冉继平

摘要：本文主要介绍了单克隆抗体、杂交瘤技术以及运用杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤。还对三种（包括人促甲状腺激素单克隆抗体、绵阳早孕因子单克隆抗体、阿莫西林单克隆抗体）不同的单克隆抗体的制备方法和临床运用做了简单的介绍。

关键词：单克隆、抗体、杂交瘤技术。

1.0 杂交瘤单克隆抗体的简介

抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

杂交瘤单克隆抗体的原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。杂交瘤技术产生单克隆抗体的步骤

一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。

二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性

三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体

2.0 单克隆抗体的实例

单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究的单克隆抗体非常的多，下文就会介绍几种单克隆抗体的的应用实例：

2．1 人促甲状腺激素单克隆抗体

人促甲状腺激素是脑垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的糖蛋白激素。血液中人促甲状腺激素含量的异常变化会起机体产生一系列甲状腺疾病例如原发性甲状腺功能减退，甲状腺肿瘤及新生儿呆小症等。给社会和家庭带来了巨大伤害。因此，临床上将血清人促甲状腺激素含量作为评估甲状腺功能是否正常的首选指标。所以建立快速精确的人促甲状腺激素检测方法成为了预防甲状腺疾病的关键。目前检测人血清人促甲状腺激素常用方法均为免疫分析法：包括兔疫放射分析和酶联兔疫等。无论哪一种方法制备特性强灵敏度高的单克隆抗体才是实现精确检测的前提。采用杂交瘤技术取经兔疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮阳性筛选和亚克隆得到能稳定高效分泌抗人促甲状腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株

由于人促甲状腺激素单克隆抗体的成功制备，成为了医学临床上检测甲状腺疾病的有效方法，是预防甲状腺疾病的关键。

2．2 绵阳早孕因子单克隆抗体

在养殖生产中及时进行妊娠诊断,减少空怀发生,是提高生产效率的重要技术措施之一。目前,绵羊妊娠诊断周期长、效率低,需要探索一种快速、高效、简便的新方法。为此,制备了绵羊早孕因子单克隆抗体,旨在为检测绵羊早期妊娠情况及评定胚胎移植效果奠定基础。

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF 重组蛋白为抗原免疫BALB/ c 小鼠,免疫4 次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合,采用间接ELISA 方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G - sepharose 柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS - PAGE 和Western blot 分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果,细胞融合后得到了1 株抗绵羊EPF 单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81. 3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊早孕因子抗体。

早孕因子在绵羊妊娠2 d 后即能检测出来,若用绵羊早孕因子单克隆抗体检测绵羊妊娠情况,则大大提前了确定绵羊怀孕的时间。若绵羊怀孕期间胎儿出现死胎,绵羊EPF 将很快从母体中消失,通过此现象还可以用绵羊EPF 单克隆抗体检测怀孕母羊腹中胎儿的生长情况。目前国内外还没有测定绵羊怀孕的商品化试剂盒或试纸条,本试验制备的绵羊EPF 单克隆抗体给此项技术提供了物质基础,若能在此基础上生产出商品化的试剂盒或试纸条,则将在绵羊早期妊娠鉴定方面具有突破性的意义。

2．3 抗阿莫西林单克隆抗体

阿莫西林属于在畜、禽养殖业广泛使用的青霉素类抗生素。目前，对畜产品或动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留量的检测主要采用高压液相色谱法和高压液相色谱-质谱串联法。这两种方法虽然敏感、准确，但是检测时间长、时效性差、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的筛选测定。开发灵敏、准确、快速的针对动物源性食品中阿莫西林免疫检测技术及其产品是对现有仪器检测方法的一个重要补充，其检测成本低、使用便利的特点能够实现企业原料和产品的现场监测。但开发该技术的关键是拥有抗阿莫西林的抗体。因阿莫西林的相对分子质量仅为419．45，不具有免疫原性，与大分子的载体蛋白交联才能更好地刺激机体产生免疫应答。：将小分子的阿莫西林交联在大分子载体牛血清白蛋白和匙孔嘁血蓝蛋白上，KLH交联物用于免疫BALB／e小鼠，采用B细胞杂交瘤技术，通过融合，筛选制备抗阿莫西林抗体。