脂肪酶活检测原理及实际方法:
一、原理以及标准曲线做法
1.对硝基苯酚酯(4-Nitrophenyl ester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种
底物,脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色,在410nm下有吸光值,且灵敏度很高。
2.所需试剂有:
CAS 碳链长度 出货号 价格 名称
830-03-5 C2 N8130-1G ¥462 对硝基苯乙酸酯
2635-54-9 C4 N9876-1G ¥570 对硝基苯丁酸酯
1956-10-1 C8 21742-1G-F ¥487 对硝基苯辛酸酯
1956-11-2 C12 61716-1G ¥435 对硝基苯月桂酸酯
1492-30-4 C16 N2752-1G ¥379 对硝基苯棕榈酸酯
14617-86-8 C18 N3627-1G ¥2621.97 对硝基苯硬酸脂
全部为色谱纯试剂,购于sigma公司
3.标准曲线绘制:
a.标准对硝基苯酚母液(2mM,2mmol / L):
称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的缓冲液),置于棕色试剂瓶内,4℃冰箱保存。
方法一:
b.标准曲线绘制:
分别取0.02,0.04,0.06,0.08,0.12,0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM),用溶液B(即不同pH的缓冲液)稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,单位:mM)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制标准曲线。
方法二:全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理,获得吸光度。
b.标准曲线的绘制:
分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和(全部都是)562.5的溶液B,40℃15min,95%乙醇,10000r / min,3min,测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线
脂肪酶酶活定义:在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位:mmol/l),y是吸光值,14.474、0.0272是反应系数,R2是相关系数。则,酶活计算公式为:
酶活=1000*n*V*(y-0.0272) / 14.474t 其中n为稀释倍数,t为反应时间(单位:min),V为反应体系的总体积(单位:L)、1000是mmol到μmol的比例。
2、底物耐碱性测定及试验液配制
1.底物耐碱性测定
a.6种底物分别加至pH7,pH8的37℃的PBS缓冲液中(选择37℃培养箱),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;
b.6种底物分别加至pH8,pH9的Tris-HCl缓冲液中(37℃),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;
c.分别加至pH9,pH10的Gly-NaOH缓冲液。
2.测酶活所需要试剂的配制,酶活测定方法
方法一:(96孔板法,粗略,速度快)
a.溶液的配制
溶液A:溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP,Sigma,或者其他底物,337.52g/mol,即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇(浓度为8.89*10-3M,或8.89mM),4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶500次测定;
溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存。
96孔板(220μL):
A液(底物液) :18μL
↗
体系液180(μL) + 酶液(40μL)
↘
B液(pH缓冲液):162μL
此步骤中,底物再次被稀释,浓度为0.889mM。
方法二:(吸光度法,精准,速度慢)
a.溶液的配制
溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP,Sigma,或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇,4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶8-10次测定,或用于8-10个酶一次测定,或用于一个酶4次密精测定;
溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存。
b.脂肪酶的活力测定(以单个酶液做一个 / 两个 对照为例)
①准备试管30个,10个15ml离心管;
②取1ml / 1.2ml溶液A加入到9ml / 10.8ml溶液B于离心管中,充分混匀,37℃水浴保温5min,分装至3 / 4个试管中,每个2.7ml,即体系液;
③向每个试管中加入适量酶液(粗酶液加300 μL),对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min),加入酶液后即为反应液;
④37℃反应10-15min,加入95%乙醇终止反应,在410nm下测定吸光值,每个样品重复2 / 3次,取平均值。
三、96孔板装样方式:
步骤一:温度不变,定为40℃,以pH和底物为变量,先在EP管内反应,后加入至96孔板中。其中每个孔是220μL体系。pH缓冲液分别采取PBS缓冲液(7、8)、Tris-HCl缓冲液(8、9)。
a.该方法需要的总酶液量(每个酶的单次实验):40*80=3.2ml,其中需要灭活的是800μL。以方便计算以及加样,取4ml酶液,1ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是(每个酶的单次试验):18*16=288μL,以方便计算和加样,取300μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液4ml,每个底物900μL。
表为96孔加样模式:C2等代表底物,后面的数字代表pH,红色字体表示一个空白对照和三个平行。蓝色字体中,pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液,以便比较不同缓冲液对酶活的影响。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | C2 7 空白 | C2 7 平行 | C4 7 空白 | C4 7 | C8 7 空白 | C8 7 | C12 7 空 | C12 7 | C16 7 空 | C16 7 | ||
B | C2 7 平行 | C2 7 平行 | C4 7 | C4 7 | C8 7 | C8 7 | C12 7 | C12 7 | C16 7 | C16 7 | ||
C | C2 8 空白 | C2 8 | C4 空白 | C4 8 | C8 空白 | C8 8 | C12 空白 | C12 8 | C16 空白 | C168 | ||
D | C2 8 | C2 8 | C4 8 | C4 8 | C8 8 | C8 8 | C12 8 | C12 8 | C16 8 | C168 | ||
E | C2 8Tri 空白 | C2 8Tri | C4 8Tri 空白 | C4 8Tri | C8 8Tri 空白 | C8 8Tri | C12 8Tri 空白 | C12 8Tri | C16 8Tri 空白 | C16 8Tri | ||
F | C2 8Tri | C2 8Tri | C4 8Tri | C4 8Tri | C8 8Tri | C8 8Tri | C12 8Tri | C12 8Tri | C16 8Tri | C16 8Tri | ||
G | C2 9Tri 空白 | C2 9Tri | C4 9Tri 空白 | C4 9Tri | C8 9Tri 空白 | C8 9Tri | C12 9Tri 空白 | C12 9Tri | C16 9Tri 空白 | C16 9Tri | ||
H | C2 9Tri | C2 9Tri | C4 9Tri | C4 9Tri | C8 9Tri | C8 9Tri | C12 9Tri | C12 9Tri | C16 9Tri | C16 9Tri | ||
步骤二:pH不变,以温度和底物为变量,先在EP管内反应,后加至96孔板中。其中每个孔是220μL体系。
a.该方法需要的总酶液量(每个酶的单次实验):40*60=2.4ml,其中需要灭活的是600μL。以方便计算以及加样,取3ml酶液,750ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是(每个酶的单次试验):18*12=216μL,以方便计算和加样,取250μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液3ml,每个底物750μL。
表为96孔加样模式其中C2等代表底物,后面的数字代表温度,红色字体表示一个空白对照和三个平行。40℃因已经在上个步骤中做过,不再重复。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | C2 30空白 | C2 30平行 | C4 30空白 | C4 30 | C8 30空白 | C8 30 | C12 30空白 | C12 30 | C16 30空白 | C16 30 | ||
B | C2 30平行 | C2 30平行 | C4 30 | C4 30 | C8 30 | C8 30 | C12 30 | C12 30 | C16 30 | C16 30 | ||
C | C2 50空白 | C2 50 | C4 50空白 | C4 50 | C8 50空白 | C8 50 | C12 50空白 | C12 50 | C16 50空白 | C1650 | ||
D | C2 50 | C2 50 | C4 50 | C4 50 | C8 50 | C8 50 | C12 50 | C12 50 | C16 50 | C1650 | ||
E | C2 60空白 | C2 60 | C4 60空白 | C4 60 | C8 60空白 | C8 60 | C12 60空白 | C12 60 | C16 60空白 | C16 60 | ||
F | C2 60 | C2 60 | C4 60 | C4 60 | C8 60 | C8 60 | C12 60 | C12 60 | C16 60 | C16 60 | ||
G | ||||||||||||
H | ||||||||||||
本文来源:https://www.2haoxitong.net/k/doc/b587cadd541810a6f524ccbff121dd36a32dc490.html
文档为doc格式