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正在进行安全检测...

发布时间：2024-01-09 04:46:08 来源：文档文库

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反转录RT-PCR的内参如何选择？RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA，再将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。1）随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。2）OligodT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。oligo(dTcapture多聚胸腺嘧啶-核苷酸捕捉实际上指的是用Oligo（dT）特异结合到mRNA上PolyA尾端的技术，以此技术可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来，通常用于mRNA的反转录3）基因特异引物：与模板序列互补，适用于目的序列已知的情况。实时PCR也就是qPCR，它的基本原理与PCR也是一样的，只是在体系中加入荧光指示，可以对PCR的模板进行定量。
一种是加入荧光染料SYBRGreen，SYBRGreen会嵌入双链DNA的小沟，且只有在嵌入小沟时才会发出荧光，荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测，通过检测每个循环后荧光强度（间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。SYBRGreen不具有特异性，对结果稍有影响。另一种是加入荧光探针Taqman，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交，而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段，此时Taq酶的5'－3'外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。Taqman特异性强，只有被扩增出目标片段时，才有荧光发出，但是价格昂贵。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/aea61ff19e314332396893db.html