薄层色谱实验讲义

实验2.11.7 薄层色谱法非那西汀和阿司匹林的测定

实验目的

了解薄层色谱的原理，薄层板的制备，应用及操作技术。

实验原理

填充柱色谱

气相

毛细管色谱

色谱的分类

高压色谱

柱色谱

制备色谱

液相

纸色谱

平板色谱

薄层色谱

薄层色谱法简称(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，薄层色谱是将固定相均匀地涂布在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法（TLC）。

（1）吸附薄层色谱：固定相为吸附剂的薄层色谱法称为吸附薄层色谱法。

分离原理：组分在吸附剂与异型剂之间发生连续不断的吸附、解吸、再吸附、再解吸，产生差速迁移得到分离。例如：将A、B两组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的流动相（展开剂）展开。此时A、B不断地被吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随展开剂向前移动。由于吸附剂对A和B具有不同的吸附能力，展开剂也对A和B有不同的溶解、解吸能力，即KA≠KB，因此当展开剂不断展开，A、B在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸，从而产生差速迁移得到分离。K值越大的组分随展开剂移动的速度越慢。如下图：



（2）比移值：组分的迁移距离（l）与展开剂的迁移距离（l0）之比称为比移值（Rf）。

Rf＝l/l0

式中，l--原点至某组分斑点中心（质量重心）的距离；l0--原点至展开剂前沿的距离。实践中，Rf值的最佳范围是0.3～0.5，可用范围是0.2～0.8。比移值描述组分斑点的位置，是薄层色谱的基本定性参数。

影响比移值的因素主要包括：①被分离物质的结构和性质。在硅胶薄层板上，极性较强的组分Rf值较小。②薄层板的性质。吸附剂的活性越强，其吸附作用就越强，使组分的Rf值越小。③展开剂的性质,。极性越强的展开剂与吸附剂的作用越强，使组分与吸附剂的作用相对减弱，Rf值增大。④展开室内的展开剂蒸气饱和程度对Rf值也有较大影响。

（3）分离度：两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（直径）的比值称为分离度或分辨率。分离度是衡量TLC系统好坏的参数。

R=2d/（W1＋W2）

式中，d--两斑点中心间的距离；W1--斑点1的宽度；W2--斑点2的宽度。

（1） 色谱的特点

（2） 设备简单，操作方便，只需要一块玻璃板和一个层析缸；（2）与纸色谱操作相同但快速，展开时间短；（3）因为使用无机物吸附剂，所以 可以采用腐蚀性显色剂；（4）可以选用各种固定相和移动相；比其它色谱法灵活；（5）与纸色谱相比，扩散小，斑点集中，灵敏度高；（6）适合小量样品，也可以大型制备；（7）技术多样化，多种展开方式和多种展开分离机理；展开方式有双向展开，多次展开，分步展开，连续展开，浓度梯度展开等，机理有吸附，分配，离子交换，电泳，等电点聚焦法等；（8）与气相色谱相比，更适合分析热不稳定，难于挥发样品。但不适合挥发性样品，仪器自动化程度低，分离效果不是很高。所以对于太复杂样品还不能分离。

（3） 　薄层扫描仪简介：

用分它是可以对斑点进行扫描的专光光度计，用可见光或紫外光作光源，线性扫描或锯齿扫描薄层板展开后的斑点，该斑点就吸收该组分特征波长的单色光，剩余的单色光经透射或反射或发射荧光，由检测器积分起来，获得这块斑点面积的待测物质含量。有透射法；反射法；萤光测定法。

锯齿扫描法 ： 用狭小的光束对一个不规则的斑点在两维空间扫描，即除了进行从左往右的水平移动外，还可进行垂直方向的移动，在这种锯齿形扫描下，双点形状、大小不规则、浓度分布不均习的影响都可小到忽略不计，因此可准确测定出斑点物质的含量。

线性扫描·

使用一个按照斑点大小的狭缝光束朝一个方向扫描斑点。

双波长测定法

双波长测定法通过使用在同一时间不同波长的双光束进行补偿，来消除因光源不稳和薄层厚度的偏差而引起的基线嗓音，使基线平稳，这样就能够鉴定细小的峰，并且还能改善测量的准确度。

荧光测定法

此法是利用荧光物质吸收特征波长的光后发射荧光，通过测定其荧光强弱来进行定量分析。荧光测定法具有灵敏度高(灵敏度比分光光度法高1—3 个数量级)，选择性高，线性范围广，以及测定结果与斑点形状无关等优点。不过．它只能测量能发射荧光的物质，而不少物质不能发射荧光。目前广泛采用衍生化技术，将非荧光物质转变为荧光物质以弥补此项缺陷

反射法

反射法是选用被测组分的特征吸收波长为入射光波长，对斑点进行扫描，测量反射光吸光度。如果工作曲线已测定．就可以从斑点所反映的色谱峰面积得到被测组分的含量。

透射法

这种方法是通过测定某组分斑点对待定波长(该组分的特征吸收波长)单色光的吸光度，来确定该组分的含量。

仪器型号ＫＨ――２０００型国产上海科哲生化有限公司当前薄层色谱分析以及中药分析需要设计的新产品，处理速度快和分辨率高,而且具有噪音小、线性好的特性。仪器由光学机械系统、薄层色谱色谱工作站、光源三大部分组成，

薄层色谱扫描仪结构示意图

固定相材料

常用薄层色谱吸附剂为硅胶和氧化铝，前者适合分离酸性和中性物质，后者适合分离碱性和中性物质。

硅胶的种类 ：

硅胶 G 含有13%---15%的煅石膏

硅胶 H 纯硅胶

硅胶 GF ---254 莹光 和粘合剂

氧化铝

碱性氧化铝 用于分离碳氢化合物 生物碱

酸性氧化铝 用于酸性成分的分离

中心氧化铝 用于醛 酮 酯 化合物的分离

有机粘合剂 羧甲基纤维素钠 CMC　分子式：[C6H7O2(OH)2CH2COONa]n

CMC，Carboxymethyl Cellulose Sodium）

本品具有粘合、增稠、增强、乳化、保水、悬浮等作用。

属阴离子型纤维素醚，为白色或乳白色纤维状粉末或颗粒，密度0.5-0.7/c㎡，几无臭、无味，具吸湿性。易于分散在水中成澄明胶状液，在乙醇等有机溶媒中不溶。1％水溶液pH为6.5～8.5，当pH＞10或＜5时，胶浆粘度显著降低，在pH7时性能最佳。对热稳定，在20℃以下粘度迅速上升，45℃时变化较慢，80℃以上长时间加热可使其胶体变性而粘度和性能明显下降。

1．ＣＭＣ 在食品中的应有

CIVIC在食品应用中不仅是良好的乳化稳定剂、增稠剂，而且具有优异的冻结、熔化稳定性，并能提高产品的风味，延长贮藏时间。在豆奶、冰淇淋、雪糕、果冻、饮料、罐头中的用量约为1％ ～1.5％。CMC还可与醋、酱油、植物油、果汁、肉汁、蔬菜汁等形成性能稳定的乳化分散液，其用量为0.2％ ～ 0.5％。特别是对动、植物油

2.CMC在医药行业的用途：在医药工业中可作针剂的乳化稳定剂，片剂的粘结剂和成膜剂。有人经基础及动物实验证明CMC是安全可靠的抗癌药载体。用CMC作膜材料，研制的中药养阴生肌散的改造剂型— —养阴生肌膜，能用于皮肤磨削手术创面和外伤性创面。

显　　色

多数情况下被分离的物质无色，须经过显色才可看见斑点。显色的方法有（1）喷洒显色法，即把一定浓度的显色剂溶液用喷雾器均匀喷洒在色谱床上；（2）薰蒸显色法，把固体碘、浓氨水、液体溴等易挥发试剂放在密闭容器内使蒸汽充满容器，再把滤纸或薄层板放入其中使之显色；以上方法显色后的斑点一般易褪色，故应用铅笔描出斑点位置。（3）紫外光显色法，含共轭双键有机物可吸收紫外光显出暗色斑点或辐射出荧光，把滤纸或薄层板置于一定波长紫外光下可见斑点，可用针沿斑点周围刺孔标出位置。

实验步棸

铺板制备方法

通常用玻璃板作基板，上面涂铺吸附剂薄层制成，有不同规格。

硬板的制备又称湿法铺层法，是把吸附剂、黏合剂和水或其他溶液先调成糊状再铺层。

1 首先将玻璃板洗净，然后将玻璃板的水沥甘。

2 用小台秤称取15g的硅胶GF—254 倒入研钵中。

3 用量筒取50 ml CMC 倒入研钵中 慢慢的调成糊状物。

4 把调好的糊状物倒在玻璃板上，慢慢震动用手缓缓转动玻板，或轻敲玻板使表面平滑， 即可。自然晾干

【如果是南方空气湿度比较大 要求活化】

。对于铺制大板，最好用涂铺器。湿法制成的板牢固，易保存，分离效果好。

点 样

点样是整个实验最关键的一步

作定量分析时，用微量注射器点样，点的直径不大于2-3mm；

注意：

1 先用无水乙醇把 注射器洗3遍

2 再用标样洗1---3遍

3 取样时要慢 点样时要快

4 取样时 一定要准确

作定性分析时，点样量不需要准确，可以用玻璃毛细管点样；

作制备时，点样为一条直线。样品应溶于挥发性溶剂中。

展 板

1 将层析缸用无水乙醇洗净

2 用量筒取 80ml 乙酸乙酯+2ml 的冰醋酸倒入层析缸中 摇匀

3 将点好板放入层析缸中 展板 观察 等待 注意边缘效应

4 然后取出板 用吹风机把板吹干 等待测试扫描

计　　算

用含量对峰高做Ｒ值的计算　

用Excel求线性回归方程

求出R值 R值越接近1 说明线形关系比较好 点样的准确度高

　线性方程称为关于的线性回归方程,称为回归系数,对应的直线称为回归直线　　利用公式求解：

y=bx+a，其中的b和a的公式！

思考题

1. 点样有哪些注意事项？

2. 薄层色谱有哪些优缺点？

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/abdfb849852458fb770b5617.html