中华人民共和国国家标准 生活饮用水标准检验方法微生物指标

中华人民共和国国家标准 生活饮用水标准检验方法微生物指标

Standard examination methods for drinking water一Microbioloical  parameters
1、菌落总数
1.1平皿计数法1.1.1范围本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。1.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。1.1.2.1菌落总数standard plate - count加cteria水样在营养琼脂上有氧条件下37℃ 培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数
1.1.3培养基与试剂1.1.3.1营养琼脂1.1.3.1.1成分：A    蛋白陈10gB    牛肉膏3g
C    氯化钠5gD    琼脂10g——20gE    蒸馏水1000ml1.3.1.2制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4一7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经103.43 kPa (121℃，15lb）灭菌20 min，储存于冷暗处备用。
1.1.4仪器

1.1.4.1高压蒸汽灭菌器。

1.1.4.2干热灭菌箱。

1.1.4.3培养箱36℃ 士2℃ 。

1.1.4.4电炉。

1.1.4.5天平。

1.1.4.6冰箱。1.1.4.7放大镜或菌落计数器。1.1.4.8 pH计或精密pH试纸。1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等1.1.5检验步骤1.1.5.1生活饮用水1.1.5.1.1门以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注人灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照1.1.5.1.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃ 培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1 ml中的菌落总数1.1.5.2水源水1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取lml充分混匀的水样，注入盛有9ml、灭菌生理盐水的试管中，混匀成1 : 10稀释液。1.1.5.2.2吸取I : 10的稀释液工ml注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成l ：10稀释液。按同法依次稀释成l : 1000 , l : 10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个——3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内以下操作同生活饮用水的检验步骤。1.1.6菌落计数及报告方法    作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。1.1.7不同稀释度的选择及报告方法1.1.7.1首先选择平均菌落数在30一300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）1.1.7.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表l中实例3）若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表l中实例4）。1.1.7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5 )1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表l中实例6）。1.1.7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30——300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。1.1.7.6若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之1.1.7.7如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm翌中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数．乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。1.1.7.8菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表I“报告方式”栏）   

 中华人民共和国国家标准   生活饮用水标准检验方法微生物指标
Standard examination methods for drinking water一Microbiolo只ical parameters   
  2、总大肠菌群
2.1多管发酵法2.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。2.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准2.1.2.1总大肠菌群total coljforms总大肠菌群指一群在37℃ 培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌2.1.3培养基与试荆2.1.3.1门乳糖蛋白膝培养液2.1.3.1.1成分 A    蛋白陈                    10g B    牛肉膏                    3g C    乳糖                      5g D    氯化钠                    5g E    嗅甲酚紫乙醇溶液（16g/L)  1mL F    蒸馏水                    1000ml2.1.3.1.2制法将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用2.1.3.2二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液〔2.1.3.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。2.1.3.3伊红美蓝培养基2.1.3.3.1成分 A  蛋白陈             10g
 B  乳糖               10g
 C  磷酸氢二钾         2g D  琼脂               20g一30g E  蒸馏水             l000ml F  伊红水溶液（20g/l) 20ml
 G  美蓝水溶液（5g/L)  13ml 2.1.3.3.2制法    将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa (115℃ ，10lb）高压灭菌20min。临用时加热融化琼脂，冷至50℃ ～55℃ ，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。2.1.3.4革兰氏染色液2.1.3.4.1结晶紫染色液A成分： a  结晶紫                 1g b  乙醇（95%，体积分数）  20mL c  草酸钱水溶液（10g/l）  80mLB制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。2.1.3.4.2革兰氏碘液A成分： a  碘               1g b  碘化钾           2g
 c  蒸馏水           300 mlB制法：将碘和碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
2.1.3.4.3脱色剂乙醇（95%，体积分数）。2.1.3.4.4沙黄复染液A成分： a  沙黄                    0.25g b  乙醇（95沉，体积分数）  10ml c  蒸馏水                  90mLB制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水2.1.3.4.5染色法A将培养18h一24h的培养物涂片。B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。2.1.4仪器2.1.4.1培养箱：36℃ 士1℃ 。2.1.4.2冰箱：0℃ ～4℃ 。2.1.4.3天平2.1.4.4显微镜。2.1.4.5平皿：直径为9cm。2.1.4.6试管2.1.4.7分度吸管：1mL , 10mL。
2.1.4.8锥形瓶2.1.4.9小倒管。2.1.4.10载玻片2.1.5检验步骤2.1.5.1乳糖发酵试验2.1.5.1.1取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白陈培养液中，取lml水样接种到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml（即0.1ml水样）注入到10ml单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管  对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10 mL水样双料培养基，每份接种10ml水样2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.0lmL甚至0.1 ,0.01 ,0.001 ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种．每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌刻度吸管。2.1.5.1.3将接种管置36℃ 士l℃ 培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2.1.5.2分离培养   将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃ 土1℃ 培养箱内培养18h——24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落2.1.5.3证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白豚培养液，置36℃ 士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在2.1.6结果报告   根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN ( most Probable number，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。乌管法结果见表2.15管法结果见表3稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
表2     用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN )
5个10ml管中阳性管数       最可能数（MPN）

 0                             < 2.2
1                             2.2
2                             5.1
3                             9.2
4                             16.0
5                             >16
2.2滤膜法2.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定2.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.2.2.1总大肠菌群滤膜法membrane rilter technique ror total coliforms总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择隆培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。 

2.2.3培养基与试剂2.2.3.1品红亚硫酸钠培养基

2.2.3.1.1成分： A  蛋白膝  10g  B  酵母浸膏  5g  C牛肉膏   5g  D  乳糖    10g

 E  琼脂   15g——20g  F  磷酸氢二钾   3.5g  G  无水亚硫酸钠 5g  H  碱性品红乙醇溶液（50g/L)  20 mL  I  蒸馏水   1000 mL 

2.2.3.1.2储备培养基的制备    先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解，于另500ml一蒸馏水中加人磷酸氢二钾、蛋白陈、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒人已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2一7.4，再加人乳糖，分装，68.95 kPa (115℃,10lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。   本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2 mL一3 mL于灭菌吸收垫上．再将滤膜置于培养垫上培养2.2.3.1.3平皿培养基的配制   将上法制备的储备培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/l的碱陛品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。   用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15 ml倾人已灭菌的空平皿内待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用

2.2.3.2乳糖蛋白膝培养液同2.1.3.1。

2.2.4仪器

2.2.4.1滤器

2.2.4.2滤膜，孔径0.45um
2.2.4.3抽滤设备
2.2.4.4无齿镊子。2.2.4.5其他仪器同多管发酵法2.1.42.2.5检验步骤2.2.5.1准备工作2.2.5.1.1滤膜灭菌：将滤膜放人烧杯中，加人蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次巧m谊。前两次煮沸后需更换水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。2.2.5.1.2滤器灭菌：用点燃的酒精棉球火焰灭菌。也可用蒸汽灭菌器l03.43kPa (121℃，151b）高压灭菌20min。
2.2.5.2过滤水样   用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注人滤器中，打开滤器阀门，在一5.07*10（4）Pa（负0.5大气压）下抽滤。2.2.5.3培养   水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分。移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃ 恒温箱内培养24h士2h。2.2.6结果观察与报告2.2.6.1挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检：紫红色、具有金属光泽的菌落；深红色、不带或略带金属光泽的菌落；淡红色、中心色较深的菌落2.2.6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白脉培养液，于37℃ 培养24h，有产酸产气者，则判定为急大肠菌群阳性2.2.6.1.2按式（1）计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100ml水样中的总大肠菌群数（CFU／100ml)报告之
总大肠菌群菌落数（CFU／100ml)=数出的总大肠菌群数*100/过滤的水样体积（ml）   
   2.3酶底物法2.3.1范围本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检测。本法可在24h判断水样中是否含有总大肠菌群及含有的总大肠菌群的最可能数（MPN）。本法可同时检测大肠埃希氏菌，见大肠埃希氏菌检测（4.3）。2.3.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.3.2.1  总大肠菌群酶底物法enzym : sub , trate technique for total coliforms  总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生价半乳糖昔酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法
2.3.3培养基与试荆2.3.3.1培养基 在本标准中酶底物法采用固定底物技术，本方法采用( MMO一MUG）培养基，可选用市售商品化制品。每1000mlMMO一MUG培养基所含基本成分为： A硫酸铵                                5.0g B硫酸锰                                0.5 rng C硫酸锌                                0.5 mg D硫酸镁                                100 mg E氯化钠                                10g F氯化钙                                50mg G亚硫酸钠                              40mg H两性霉素B                             1mg 1邻硝基苯件-β-D-毗喃半乳糖普（ONPG )     500mg J4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸普（MUG )    75mg K茄属植物萃取物（solanium萃取物）       500mg L N-2-乙基呱嗓NZ乙磺酸钠盐（HEPES钠盐） 5.3g M N-2-乙纂呱嗦NZ乙磺酸（HEPEs )            6.9g 2.3.3.2生理盐水    8.5g/l的生理盐水，用于稀释样品成分：
氯化钠    8.5g蒸馏水加至1000mL   溶解后．分装到稀释瓶内，每瓶90mL , 103.43kPa ( 121℃, 15lb) 20min高压灭菌
2.3.4仪器设备2.3.4.1量筒：100ml、500ml、l000ml。2.3.4.2吸管：lml、5ml及10ml的无菌玻璃吸管或塑料一次性吸管2.3.4.3稀释瓶：100ml、250ml、500mL及1O00ml能耐高压的灭菌玻璃瓶2.3.4.4试管：可高压灭菌的玻璃或塑料试管，大小约15mm*10cm。2.3.4.5培养箱：36℃ 士1℃ 。2.3.4.6高压蒸汽灭菌器。2.3.4.7于热灭菌器（烤箱）。2.3.4.8定量盘：定量培养用无菌塑料盘，含51个孔穴，每一孔穴可容纳2ml水样。
2.3.4.9程控定量封口机：用于51孔或97孔法（MPN法，最可能数法）定量盘的封口。
2.3.5检验步骤2.3.5.1水样稀释    检测所需水样为100mL若水样污染严重，可对水样进行稀释。取10mL水样加人到90ml灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。2.3.5.2定性反应  用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入2.7g士0.5gMMO—MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解后，放人36℃士1℃ 的培养箱内培养24h。2.3.5.3 10管法2.3.5.3.1用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加人2.79士0.5gMMO—MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解2.3.5.3.2准备10支15mm*10cm或适当大小的灭菌试管，用无菌吸管分别从前述稀释瓶中吸取10ml水样至各试管中，放人36℃ 士1℃ 的培养箱中培养24h。2.3.5.4  51孔定量盘法2.3.5.4.1用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加人2.7g士0.5gMMO一MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。2.3.5.4.2将前述100 ml水样全部倒人51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。放入36℃士1℃ 的培养箱中培养24h。
2.3.6结果报告2.3.6.1结果判读   将水样培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。2.3.6.2定性反应   水样经24h培养之后如果颜色变成黄色，判断为阳性反应，表示水中含有总大肠菌群。水样颜色未发生变化，判断为阴性反应定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告2.3.6.3   10管法2.3.6.3.1将培养24h之后的试管取出观察，如果试管内水样变成黄色则表示该试管含有总大肠菌群。2.3.6.3.2计算有黄色反应的试管数，对照表4查出其代表的总大肠菌群最可能数（MPN）。结果以MPN/100 mL表示。如所有管未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。
2.3.6.4  51孔定量盘法2.3.6.4.1将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总大肠菌群。
2.3.6.4.2计算有黄色反应的孔穴数，对照表5查出其代表的总大肠菌群最可能数（MPN）。结果以ml表示。如所有孔未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。   

3.1多管发酵法3.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的耐热大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中耐热大肠菌群的测定。3.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1.2.1耐热大肠菌群thermotolerant coliform bacteria用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃ 仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。3.1.3培养基与试剂3.1.3.1 EC培养墓3.1.3.1.11成分： A  胰蛋白脉            20g B  乳糖                5g C  3号胆盐或提合胆盐〕 1.5g D  磷酸氢二钾          4g
 E  磷酸二氢钾       1.5g F  氯化钠           5g G  蒸馏水           1000mL3.1.3.1.2制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，分装到带有倒管的试管中，68.95 kPa (l15℃，10lb）高压灭菌20min，最终pH为6.9士0.23.1.3.2伊红美蓝琼脂同2.1.3.33.1.4仪器3.1.4.1恒温水浴：44.5℃ 士0.5℃ 或隔水式恒温培养箱。3.1.4.2其他同总大肠菌群多管发酵法（2.1.4.1——2.1.4.9 )3.1.5检验步骤3.1.5.1自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中．置44.5℃ 水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h士2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃ 培养18h—24h，凡平板L有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性3.1.5.2如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群2.1.5工接种乳糖蛋白陈培养液在44.5℃ 士0.5℃ 水浴中培养，以下步骤同3.1.5.1。3.1.6结果报告根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每100 mL水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）值。3.2滤膜法3.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及低浊度水源水中的耐热大肠菌群本法适用于生活饮用水及低浊度水源水中耐热大肠菌群的测定3.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.2.2.1  耐热大肠菌群滤膜法mcmbrane filter technique for thermotolerant colifl甘nl bacteria耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，44.5℃ 培养24h能形成特征性菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法3.2.3培养基与试荆3.2.3.1 MFC培养基3.2.3.1.1成分 A  胰陈           10g B  多陈           5g C  酵母浸膏       3g D  氯化钠         5g E  乳糖           12.5g F  3号胆盐或混合胆盐  1.5g
 G  琼脂               15g H  苯胺蓝             0.2g I  蒸馏水             1000ml
3.2.3.1.2制法  在l000mL蒸馏水中先加人玫红酸（10g/l）的0.2mol/L氢氧化钠溶液10mL，混匀后，取500mL加人琼脂煮沸溶解，于另外500ml蒸馏水中，加人除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒人已溶解的琼脂，混匀调pH为7.4，加人苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
   制好的培养基应存放于2℃ ～10℃ ，不超过96h。   本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基使用时加2mL——3mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养3.2.3.2 EC培养基同3.1.3.13.2.4仪器3.2.4.1隔水式恒温培养箱或恒温水浴3.2.4.2玻璃或塑料培养皿：60mm*15mm或50mm*12mm。3.2.4.3其他仪器同2.2.43.2.5检验步骤3.2.5.1准备工作同2.2.5.1。3.2.5.2过滤水样同2.2.5.2。3.2.5.3培养：水样滤完后，再抽气约5s，关仁滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放人44.5℃ 隔水式培养箱内培养24h士2h。如使用恒温水浴，则需用塑料平皿，将皿盖紧，或用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠封人塑料袋内，浸到44.5℃ 恒温水浴里，培养24h士2h耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。3.2.5.4对可疑菌落转种EC培养基，44.5℃ 培养24h士2h，如产气则证实为耐热大肠菌群
3.2.6结果报告   计数被证实的耐热大肠菌落数，水中耐热大肠菌群数系以100ml，水样中耐热大肠菌群菌落形成单位（CFU）表示，见式（2）。
耐热大肠菌菌落数（CFU/100ml）=所计得的耐热大肠菌菌落数*100/过滤的水样体积（mL )   

4、大肠埃希氏菌
4.1多管发酵法4.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌。本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定。4.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准4.1.2.1大肠埃希氏菌多管发酵法multiple tube fermentation technique for Escherichia coli大肠埃希氏菌多管发酵法是指多管发酵法总大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃ 培养24h产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法4.1.3培养基与试剂4.1.3.1 EC - MUG培养基4.1.3.1.1成分 A  胰蛋白陈                              20.0g B  乳糖                                  5.0g C  3号胆盐或混合胆盐                     1.5g D  磷酸氢二钾                            4.0g E  磷酸二氢钾                            1.5g F  氯化钠                                5.0g G  4-甲基伞形酮书-β-D-葡萄糖醛酸昔（MUG）0.05g4.1.3.1.2制法  将干燥成分加人水中，充分混匀，加热溶解，在366nm紫外光下检查无自发荧光后分装于试管中，68.95 kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，最终pH为6.9士0.2
4.1.4仪器4.1.4.1紫外光灯：6W、波长366nm的紫外灯，用于观测荧光反应4.1.4.2培养箱：36℃ 士1℃ 。4.1.4.3天平。4.1.4.4平皿：直径为9cm4.1.4.5试管4.1.4.6分度吸管：1 ml , 10 mL4.1.4.7锥形瓶。4.1.4.8小倒管4.1.4.9金属接种环4.1.4.10冰箱：O℃ 一4℃ 。4.1.5检验步骤4.1.5.1接种   将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG管中。4.1.5.2培养  将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.5℃ 士0.5℃ 培养24h士2h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴的液面超过EC-MUG管的液面。4.1.6结果观察与报告  将培养后的EC一MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。计算EC-MUG阳性管数，查对应的最可能数（MPN）表得出大肠埃希氏菌的最可能数，结果以MPN/100 ml报告。4.2滤膜法4.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定4.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。4.2.2.1大肠埃希氏菌谁膜法membrane rilter technique for Escherichia coli用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生-β-葡萄糖醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。4.2.3培养基与试剂4.2.3.1 MUG营养琼脂培养基（NA—MUG )
4.2.3.1.1成分 
A  蛋白陈                             5.0g 
B  牛肉浸膏                           3.0g 
C  琼脂                               15.0g 
D  4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷（MUG）0.1g
E  蒸馏水                              1000 ml
4.2.3.1.2制法   将干燥成分加入水中，充分混匀，加热溶解．103.43kPa ( 121℃，15lb）高压灭菌15min，最终pH为6.8士0.2在无菌操作条件F倾倒直径50mm平板备用。倾倒好的平板在4℃条件下可保存两个星期  本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL——3ml于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养4.2.4仪器4.2.4.1紫外光灯：6W、波长366 nm的紫外灯，用于观测荧光反应4.2.4.2其他仪器同2.2.44.2.5检验步骤4.2.5.1接种   将总大肠菌群滤膜法有典型菌落生长的滤膜进行大肠埃希氏菌检测。在无菌操作条件下将滤膜转移到NA-MuG平板上，细菌截留面朝上，进行培养4.2.5.2培养将已接种的NA-MUG平板36℃士1℃培养4h。4.2.6结果观察与报告  将培养后的NA-MUG平板在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告，报告格式同总大肠菌群滤膜法格式   

4.3酶底物法4.3.1范围本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的检测本法可在24h判断水样中是否含有大肠埃希氏菌及含有的大肠埃希氏菌的最可能数（MPN）值。本法可同时检测总大肠菌群，方法见23。4.3.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。4.3.2.1大肠埃希氏菌酶底物法即zyme substrate technique for Escherichia coli在选择性培养基上能产生β一半乳糖苷酶分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生β一葡萄糖醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光；以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
4.3.3培养基与试荆培养基与试剂同2.3.3。4.3.4仪器设备4.3.4.1紫外光灯：6W、波长366 nm的紫外灯，用于观测荧光反应4.3.4.2其他仪器同2.3.4。4.3.5检验步骤检验步骤同2.3.54.3.6结果观察与报告4.3.6.1结果判读结果判读同2.3.6.1，对照表同表4与表5。水样变黄色同时有蓝色荧光判断为大肠埃希氏菌阳性，水样未变黄色而有荧光产生不判定为大肠埃希氏菌阳性4.3.6.2定性反应将经过2或I，培养颜色变成黄色的水样在暗处用波长为366 nm的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生判断为阳睦反应，表示水中含有大肠埃希氏菌。水样未产生蓝色荧光判断为阴性反应。结果以大肠埃希氏菌检出或未检出报告。4.3.6.3 10管法4.3.6.3.1将培养2连h颜色变成黄色的水样的试管在暗处用波长为366 nm的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生则表示有大肠埃希氏菌存在4.3.6.3.2计算有荧光反应的试管数，对照表4查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数。结果以MPN/100ml表示。如所有管未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。4.3.6.4 51孔定量盘法4.3.6.4.1将培养24h颜色变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射，如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌。4.3.6.4.2计算有荧光反应的孔穴数，对照表5查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数。结果以MPN 100 ml表示。如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。   
   5、贾第鞭毛虫5.1免疫磁分离荧光抗体法5.1.1范围本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及其水源水中的贾第鞭毛虫抱囊和隐抱子虫卵囊。本法适用于生活饮用水及水源水中贾第鞭毛虫抱囊和隐抱子虫卵囊的测定5.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。5.1.2.1贾第鞭毛虫glardia一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫有两个种．它们的宿主是：人类和鼠类。5.1.2.2隐抱子虫cryptosporidium一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，有6个种，且它们可能的宿主是：哺乳类动物，包括人类；鸟类；鼠类；爬行类和鱼类。5.1.3器材与试剂5.1.3.1采样器材5.1.3.1.1 Envirochek方法A蠕动泵；B泵管；C Evlrocheck滤囊（醚矾滤膜，有效过滤面积1300crn，孔径1.0um) ;D夹子；E水表；F流量控制阀；G过滤管；H塑料连接5.1.3.1.2 FIlta一Max方法A FIlta一Max滤芯：压缩后的多孔海绵滤膜模块（共60层多孔海绵滤膜从600 mm压缩到30mm，其中单层多孔海绵滤膜厚10mm，外径55mm，内径15mm) ;B Filta一Max滤器：带进出水样口及配套软管和辅助工具的FiltaMax滤器；C 合适的压力泵（导流泵，蠕动泵等）；D 泵管；E夹子；F水表；G 流量控制阀（IL/mln ——4l／min）。5.1.3.1.3 Filta一MaxXpress快速方法A FiltaMaxXpresS决速滤芯；B Fllta一MaXpres、滤器带进出水样口及配套软管和辅助工具的Fllta—MaxXpress滤器；C合适的压力泵（导流泵，蠕动泵）;D泵管；E夹子；F水表；G流量控制阀（IL/mln ——4l／min）。5.1.3.2淘洗／浓缩／纯化器材5.1.3.2.1 Envirochek方法A过滤夹：带臂水平振荡装置，臂有垂直安装的过滤夹，最大频率600r/min ;B 175ml锥形离心管；C离心机：容量175 ml刻度锥形离心管和能达到1500g的加速度的离心机；D旋涡搅拌器；E塑料吸耳球；F 10mL移液管；G 5omL移液管；H 100mL有刻度的量筒；l一侧平面试管，125mm*16mm，带管塞，一侧为60mm*10mm平面；J用于一侧平面试管的磁颗粒浓缩器〔 MPCM ) ;K锥形具塞5 ml一微量离心管；I巴斯德移液管5.1.3.2.2 FIlta一Max方法A、手动或自动Filt-Max淘洗主设备及配套装置（浓缩管及底座，洗涤管及不锈钢虹吸管）; 
B手动真空泵；C磁力搅拌器和搅拌棒；D滤膜（3.0um），直径73 mm5.1.3.2.3 Filta一Max Xpree快速法A Filta一Max Xpree快速淘洗装置；B空气压缩机，至少0.4 MPa以上压力．151压缩空气；C容量500ml刻度锥形离心管和能达到20009加速度的离心机；D 5OOml、锥形离心管；E蠕动泵。5.1.3.3染色器材5.1.3.3.1三通真空泵。5.1.3.3 .2湿度孵化盒。5.1.3.3.3显微镜玻璃井形载玻片（井的直径为9mm )，容积100ul。5.1.3.3.4玻璃盖玻片。5.1.3.3.5 37℃ 培养箱。5.1.3.3.6荧光显微镜。5.1.3.3.7 450nm～480 nm的蓝色滤光片。5.1.3.3.8 33Onm-385nm的紫外光滤光片。5.1.3.3.9 20倍、40倍、100倍的目镜5.1.3.3.1O测微计。5.1.3.3.11 5ul——20ul的可调微量移液管。5.1.3.3.12 20uL一200uL的可调微量移液管5.1.3.3.13 200ul-1000ul的可调微量移液管   
   5.1.3.4接种器材5.1.3.4.1小口塑料瓶（20L )5.1.3.4.2 Mallasez或修改的Neubauer血球计数器。  所有玻璃器皿和塑料管都必须在使用后及洗涤前经高压消毒。用热的浓洗涤剂溶液清洁器材，然后将它们放到浓度最小为509 / L的次氯酸钠溶液中，至少在室温浸泡30 min。用蒸馏水冲洗器材，然后将其放到没有卵囊的环境中干燥。尽可能使用一次性物品。5.1.3.5试剂5.1.3.5.1超纯水5.1.3.5.2 15Ommol/lPBS溶液（磷酸缓冲盐）A成分： NaCL         8.5g Na2HPO4      1.079 Na2HPO4.2H2O 0.39g加超纯水到1000ml B制法：用盐酸或氢氧化钠将pH调到7.2士0.1，在4℃ 可储存1个星期
5.1.3.5.3贾第鞭毛虫／隐袍子虫免疫磁分离（IMS）试剂盒A抗隐抱子虫单克隆抗体磁微粒；B抗贾第鞭毛虫单克隆抗体磁微粒；C 10SL缓冲液A (15mL)，透明无色；D 10SL-M缓冲液B(loml)，品红色。将免疫磁分离（IMS）试剂盒，4℃ 储存。5.1.3.5.4免疫荧光试剂盒抗隐抱子虫／贾第鞭毛虫单克隆抗体一异硫氰酸盐荧光素试剂盒（5mL )，于4℃ 储存
5.1.3.5.5封固剂：2%DABCO／甘油。A成分：甘油／PBS缓冲盐溶液（60%/40%) 100 mL DABCO                          2gB保存：室温条件下储存12个月。5.1.3.5.6 1mol/LTris , pH7.4  在1000 mL超纯水中溶解132.29的TriS盐酸；然后再加19.49的TriS碱。用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.4士0.1。用孔径0.2um的滤膜将它过滤灭菌后，移到一个无菌的塑料容器中室温条件下储存6个月。5.1.3.5.7  0.5mol/lNa2—EDTA , pH8.0。将37.22g乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物（Na2一EDTA）溶解到200 mL的超纯水中，然后用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到8.0士0.1，室温条件下储存6个月。5.1.3.5.8淘洗缓冲液。A Envirochek淘洗缓冲液：月桂醇聚醚12 ( Laureth一12 )    4g 1mol/lTris , pH7.4              4Oml 0.5mol/l  Na2一EDTA , pH8.0     8 mL A型止泡剂                       600ul 加超纯水到4000mL    称取1g月桂醇聚醚12到玻璃烧杯中，然后加100 mL超纯水。用电炉或微波炉将烧杯加热，使月桂醇聚醚一论溶解，然后再将其转移到1 000 ml有刻度的量筒中。用超纯水将烧杯冲洗几次，确保所有的洗涤剂都转移到量筒中。加10mLpH为7.4的TriS溶液；2mLpH为8.0的Na2一EDTA溶液和150ulA型止泡剂最后用超纯水稀释到1000mL。室温条件下储存l个月。 B FiltaMax淘洗缓冲液（PBST缓冲液）: Na2HPO4      1.44g KH2PO4       0.24g KCl          0.2g NaCI         8g非离子表面活性剂Tween-20    0.1mL超纯水        900mL将1.44g磷酸氢二钠、O.24g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾及89氯化钠加人900mL超纯水，搅拌20 min至完全溶解，加人0.lm工非离子表面活性剂Tween20并继续搅拌10min，然后用超纯水稀释至1 000 ml．。C、FiltaMaxPress决速法淘洗缓冲液（PETT缓冲液）:焦磷酸四钠          0.29EDTA柠檬酸三钠      0.39 Tris一HCI (1mol/l) 10 mL Tween8O             0.1 mL将0.2g焦磷酸四钠和0.3gEDTA柠檬酸三钠加人900ml，超纯水，搅拌10min使之完全混合。然后加人10 mL 1.0mol/L TrisHCI并搅拌5min使之混合。再加人0.1 ml Tweenso并搅拌10min混合（Tween80粘度高，吸取时务必注意）。最后用超纯水稀释至1000mL，并调节pH至7.4士0.2 5.1.3.5.9   0.1mol/l盐酸溶液。5.1.3.5.10   lmol/L氢氧化钠溶液5.1.3.5.11   纯甲醇。5.1.3.5.12    DAPJ储存溶液：在一个含有1mg4，6一二氨基一2苯基引噪（DAPI）的烧瓶中，注人500川的纯甲醇（2mg/l）。4℃ 暗处储存15天。5.1.3.5.13    DAPI染色溶液：用50mLPBS稀释10ulDAPI母液每日配制并将它储存在暗的4℃环境中。5.1.3.5.14  50g/L的次氯酸钠溶液。5.1.3.5.15 碱胜洗涤剂5.13.5.16 纯的Giar山alalnbl血抱囊：浓度为100个袍囊／ml，能在4℃ 储存2个月。
5.1.3.5.17 纯的Cryptoporidium paruuum卵囊：浓度为100个卵囊／mL，能在4℃ 储存2个月
注：对于储存了2个月以上的卵囊存储液．可以在对其浓度和荧光的强度检查之后继续使用   

5.1.4分析步骤5.1.4.1采样／淘洗／浓缩因水样中的卵囊数量很少，因此需要浓缩较大体积的水样，采样的体积取决于水样的类型：体积（L)原水    20L处理水  10OL5.1.4 .1.1 Envirochek方法A采样系统的组成a一次性使用的，孔径1um，褶聚醚矾滤纸的滤囊；b压力标定在0.21 MPa的控制阀（对于处理水来说是可任意选择的）;C连接在滤囊出口的水表，能控制过滤水样的体积；d流量能达到2l/ min的蠕动泵B采样a连接滤囊以外的采样系统。b打开蠕动泵的开关，并将流量调到2l/ min。c在作业线上安装滤囊，用适当的夹子将滤囊的进口和出口固牢d记录水表上指示的体积e将采样系统连接到自来水龙头或其他水源上。于通过滤囊过滤适当体积的水样。g在过滤结束的时候，记录滤囊过滤的水样体积b将连接在水源上的采样系统取下i打开泵，尽快把滤囊放空。过滤后，要将滤囊放到4℃ 的暗处存放，一般不要超过72h C淘洗a取下滤囊进水口的乙烯栓，用量筒加110m工，左右的淘洗缓冲液到每个滤囊的外腔中b将滤囊插到带臂水平振荡器的夹钳上，滤囊的出水阀在12点钟的位置。C打开振荡器的开关，将速度设在最大速度的80%，然后将样本振荡10 mind将滤囊中的淘洗液倾注到175ml的锥形离心管中．再用110mL的淘洗缓冲液将滤囊的外腔再充满e将过滤器插到振荡器的夹钳上，这次出水阀的位置是它原来位置沿着它的轴方向转90°角。在80％的功率下，再摇10min。f重复操作步骤d，将乙烯帽小心取下，将滤囊中的淘洗液倾注到175 mL的锥形离心管中D浓缩a将装有淘洗液样本的175 mL离心管置1500g离心15min自然地减速，以免扰乱沉淀物
b用移液管小心地将上清液吸掉，使上清液刚好到沉淀物的上面为止（不要扰乱沉淀物）。
c如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5 mL，就要加试剂水到离心管中，使其总体积为10 mL将试管置于旋转式搅拌器10s一15s，以便使沉淀物再悬浮。d如果压实的沉淀物体积大于0.5 mL，就要用式（3）确定在离心管中需要的总体积：总需要体积（mL）=沉淀物体积*10ml/0.5ml.....（3 )
   以便将再悬浮的沉淀物调整到一个0.5ml相同压实的沉淀物体积，加试剂水到离心管中，使其总体积达到仁面计算的水平。将试管旋转搅拌10s—15s，以便使沉淀物再悬浮记录这个再悬浮物的体积。5.1.4.1.2  Filta - Max方法A采样a将滤芯（螺栓头朝下）安装在支架上，拧紧盖子（盖子即为进样口）b将过滤装置连接到需采样的水源注1：为使液体流经滤芯斋在顶部施加0.05MP。的压力。推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为3l/min—4L/min。工作压力最大不应超过0.8MMPa。注2：采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置，应安装在过滤装置上游。注3：样品采集可在水源现场或实验室完成B淘洗与浓缩在淘洗与浓缩过程中，参考生产商的手动或自动淘洗装置使用手册操作。a手工淘洗步骤1）第一次淘洗。将3um滤膜放置到浓缩器中．组装好浓缩管和洗涤管。将过滤模块（滤芯）从支架上取下，安装到淘洗器的活塞顶部将淘洗器的狭口与洗涤管用决接头连接。拉下淘洗器的延伸臂至锁住，从过滤模块上去除螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注人600 mL PBST缓冲液，随后连接到快接头上将活塞上下活动20次，以冲洗解压的过滤模块拆下浓缩管，挤压活塞5次以清除过滤器中的残留液体。2）第一次淘洗液浓缩将浓缩管与磁性搅拌棒连接，放置在磁性搅拌盘上，以60r/min一12r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上，形成压力为13. kPa —0.0 kPa的真空。打开活栓，使流出液浓缩到30 mL——40 ml。将浓缩液轻轻倒人50 mL离心管中。3）第二次淘洗浓缩管中重新加人600 mL PBST缓冲液，再连接到洗涤管上。重复第一次淘洗过程，只需10次。4）第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加人到第二次的淘洗液中按上述方法重复浓缩过程。5）将3um滤膜转移到提供的袋子中，加人5 m1PBST缓冲液，隔着袋子用手轻轻磨擦滤膜。如此，清洗2次。将清洗液与浓缩液混合。b自动淘洗步骤1）第一次淘洗。将3um滤膜放置到浓缩器中，组装好浓缩管和洗涤管。打开自动淘洗器电源。将过滤模块从支架上取下，安装到淘洗器的活塞顶部。将淘洗器的狭口与淘洗管用决接头连接。按控制面板上的F1键，卸下过滤模块上的螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注人600 mL PBST缓冲液，随后连接到快接头上。按F1键开始初次浸润，然后按F3键进行第一次淘洗。拆下浓缩管，按F4键以清除过滤器中的残留液体。2）第一次淘洗液浓缩。将浓缩管与磁性搅拌棒连接，放置在磁性搅拌盘上，以60r / min一120r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上，形成压力为13.3kPa ——40.0 kPa的真空。打开活栓，使流出液浓缩到30 mL一40 ml。将浓缩液轻轻倒人50ml离心管中3）第二次淘洗。浓缩管中重新加人600 mL PBST缓冲液，再连接到洗涤管上。按F3键开始淘洗。拆下浓缩管，按F4键以清除过滤器中的残留液体。4）第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加人第二次的淘洗液中。按上述方法重复浓缩过程。
5）将3um滤膜转移到提供的袋子中，加人5ml一PBST缓冲液，隔着袋子用手轻轻磨擦滤膜。如此，清洗2次。将清洗液与浓缩液混合。5.1.4.1.3 Fjlta一MaxXpress快速方法A采样a将过滤模块（螺栓头朝下）安装在支架上，拧紧盖子（盖子即为进样口）。b将过滤装置连接到需采样的水源。注1：为使液体流经滤膜需在顶部施加0.05MPa的压力．推荐的005MPa工作压力形成的液体流速为3L/min一4L/min。工作压力最大不应超过。SM目。注2：采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置，应安装在过滤装置上游注3样品采集可在水撅现场或实验室完成注4本方法亦适用于浊度高的水源水的采样．B淘洗采用Filta一Max xpress压力淘洗装置可使淘洗过程全自动完成。详细操作程序参见生产商使用指南将压力淘洗装置准备就绪，向缓冲液槽中加入足量的淘洗缓冲液，利用厂商提供的连接锁合将缓冲液槽与压力淘洗装置连接，确保二者之间形成良好密封。连接压缩空气源和压力淘洗装置，保证足够的空气压力和体积。打开压力淘洗装置后面的封闭阀。淘洗步骤为：a打开压力淘洗器b过滤装置进样口朝上，移开样品阻留器，连接出样口分流装置（过滤模块仍在过滤装置内）。
c将过滤装置倒转，用快接头连接到压力淘洗器上。d将50001锥形离心瓶放置在样品收集器支架上，关闭压力淘洗装置。e按控制面板的Fl键，开始自动淘洗。f淘洗结束时，打开压力淘洗装置卸下过滤装置，再拿开出样分流装置，打开过滤装置，弃掉过滤模块。g将离心瓶盖好，从样品收集器支架中取出。C浓缩a将装有淘洗液样本的500 mL离心管置2000g离心15min。漫慢地减速，以免搅起沉淀物。记录沉淀物体积。注意：勿用制动器！b离心后，用吸气装置将沉淀物上层8 mL一10 ml处的悬浮物小心吸出（吸气装置的真空应小于3.3 kPa。
   如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL，将试管置于旋转式搅拌器20s，然后将样品转人Leighton管中；用lml试剂水冲洗离心瓶两次，清洗液转人同一Leighton管中d如果压实的沉淀物体积大于0.5 ml，就要用式（4）确定在离心管中需要的总体积，以便将再悬浮的沉淀物调整到相当于0.5mL压实沉淀物的体积。   总需要体积（mL）=沉淀物体积*10ml/0.5ml· · · · · · ·（4 )
   加试剂水到离心管中，使其总体积达到上面计算的水平。将试管旋转搅拌105一155，以便使沉淀物再悬浮。记录这个再悬浮物的体积   
   5.1.4.2 IMS分离5.1.4.2.1试剂制备A由10火SLA型缓冲液配制稀释的1火SIA型缓冲液用试剂水作为稀释剂每个样品制备lmL的1只SIA型缓冲液。注意：长时间在O℃ ～4℃ 储存后，可能会在IOxSL一A型缓冲液中形成一些结晶沉淀。为了确保这些沉淀的结晶能够再溶解，使用前应将其置室温（15℃ ～22℃ ）恒温H加lm工一10只SLA型缓冲液和1 mL 10*SL B型缓冲液到一侧平面试管中5.1.4.2.2卵囊捕获A定量转移10m工水样浓缩物到含有SI、缓冲液的一侧平面试管中H将抗隐抱子虫抗体和抗贾第鞭毛虫的磁微粒原液置于漩涡混合器上搅拌，以便使珠粒悬浮通过倒置试管的方法保证珠粒再悬浮．并确定底部没有残留的小团。C在含有水样浓缩物和SI、一缓冲液样品的一侧试管中各加100川上述悬浮的微粒。D将样品试管固定到旋转式的搅拌器上，在大约25r/min的条件下至少旋转lh E至少旋转lh后．将试管从搅拌器上取下，然后再将其放在磁粒浓缩器（MPC一1）上，并将试管有平面的一边朝向磁铁F用手柔和地大约900角头尾相连地摇动试管，使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜以每秒大约倾斜一次的频率持续2minG如果让MPC-I中的样品静置105以上，就要在进行下一个步骤之前，重复前一个（即步骤F)步骤。H立即打开顶端的盖，同时将保持在MPC一1上的试管中的所有上清液倒到一个适当的容器中做这一步骤时，不要摇动试管，也不要将试管从MPcl土取下I将试管从MPCI上取下，加lmLX SL一A型缓冲液非常柔和地将试管中的所有物质再悬浮。不要形成漩涡。J将样品试管中的所有液体定量转移到有标签的1 . smL微量离心管中K将微量离心管放到另一磁粒子浓缩器（MPCM）中，MPCM在放微量离心管的位置有一根磁条。L用手180°角轻轻地摇动试管每秒大约摇动一个180°角的频率，持续大约1 min在这一步结束时，珠粒和卵囊会在试管的背面形成一个褐色圆点。M立即从留在MPCM上的试管和顶盖中的上清液吸出。如果同时处理一个以上的样品，就要在吸去每个试管的上清液之前，进行3个180°角的摇动或滚动的动作。小心不要扰乱与磁铁邻近管壁上的附着物不要摇动试管。当进行这些步骤时，不要将试管从MPCM上取下5.1.4.2.3磁珠与抱（卵）囊复合物的分离A将磁条从MPC一M上取下B加50ul 0.1 mol/l的盐酸（HCI）至上述微量离心管中，用涡旋棍合10s。C将试管放在MPC一M上，然后让它在室温垂直静止10min。D用力涡旋5s——10s.E保证所有样品都在试管的底部，然后将微量离心管放在DynalMPcM上
F再将磁条放到MPCML，然后大约90°角头尾相连地轻轻摇动试管。使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜，以每秒大约倾斜一次的频率持续305G准备一个井型载玻片，然后加5ul 1mol/l的氢氧化钠（NaOH）溶液至样本井中。H不要将微量离心管从MPCM上取下将所有样品从MPCM上的微量离心管中转移到有氢氧化钠的样品井中。不要扰乱试管背壁上的珠粒。l重复步骤A一F，然后将样品转移到相同的井形载玻片上5.1.4.3染色5.1.4.3.1将有样品的井形载玻片放到42℃的培养箱中，蒸发干5.1.4.3.2在每一含有干样品的井中加一滴（50ul）纯甲醇，然后让它空干3 min——5 min。
5.1.4.3.3用试管准备所需体积（每井50ul）的抗隐抱子虫抗体和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体异硫氰酸荧光素（FITC）工作稀释液。5.1.4.3.4加50ul用上述异硫氰酸荧光素（FITC）单克隆抗体工作稀释液至含样本井中。将载玻片放到湿室中于37℃培养30 min左右5.1.4.3.5 30min后，取出载玻片，然后用一个干净的顶端带有真空源的巴斯德移液管轻轻地从每个井边吸掉过量的荧光素标记单克隆抗体5.1.4.3.6在每个井中加70ul的PBS，静止1min一2 min后．吸掉多余的PBS。5.1.4.3.7加50ulDAPI溶液（使用时配制，即加10ul2mg/ml溶于纯甲醇中的DAPI于50ml的PHS中）到侮个井中，然后让它在室温静止2面n左右。5.1.4.3.8吸掉过量的DAPI溶液。5.1.4.3.9加70uL的PBS到每个井中，静止1 min一2 mln后，吸掉多余的PBSo5.1.4.3.1O加70ul的试剂水到每个井中，静止lmin后，吸掉多余的试剂水5.1.4.3.11 让载玻片在暗处干燥后，加一滴含防荧光减弱的封固剂到每个井的中心。
5.1.4.3.12在井形载玻片上盖七盖玻片，然后将它存放在干燥的暗盒中，备查   
   5.1.4.4镜检  打开显微镜和汞灯。预热10min后，在200倍的荧光显微镜下检查，在400倍的荧光显微镜下进一步证实。井将全井进行记数。  贾第鞭毛虫的袍囊是椭圆形的它们的长度为8um-14um，宽度为7um-10um。抱囊壁会发出苹果绿的荧光。在紫外光下，DAPI阳性抱囊会出现4个亮蓝色的核。隐抱子虫的卵囊为稍微椭圆的圆形。它们的直径为2um-6um。卵囊壁会发出苹果绿的荧光在紫外光下．DAPI阳性卵囊会出现4个亮蓝色的核计数整个井面，呈现表6特征的就是抱（卵）囊。
5.1.5结果的计算、报告和检测限5.1.5.1用式（5）报告每升样本中的抱（卵）囊数：Y一（X*V ) / ( V1*V2 · · · · · · · … （5 )式中：y每升水中抱囊或卵囊的数目；X― 计数样本的体积中抱囊或卵囊的数目；V― 离心后再悬浮的体积，单位为毫升（mL ) ;V1― 计数样本的体积，单位为毫升（mL ) ;V2― 过滤后水的体积，单位为升（L ) ;5.1.5.2用式6计算分析的检测限：D一V / ( V1*V2）· · · · （6 )式中：D一一每升抱囊或卵囊的检测限；V― 离心后再悬浮的体积，单位为毫升（mL ) ;V1― 计数样本的体积，单位为毫升（mL ) ;V2一过滤后水的体积，单位为升（I .）。5.1.6质量控制5.1.6.1免疫荧光质量控制免疫荧光试剂盒的控制必须每个星期做一次它由两个试验组成：一个阳性对照和一个阴性对照
5.1.6.2阴性对照5.1.6.2.1制准备一个井形载玻片。5.1.6.2.2加50uL蒸馏水，然后将它放在培养箱中干燥。5.1.6.2.3参照5.1.4.3染色5.1.6.2.4对整个井面进行计数。不得找出任何贾第鞭毛虫囊和隐抱子虫的卵囊。5.1.6.3阳性对照5.1.6.3.1制备一个井形载玻片5.1.6.3.2涡旋储存的原虫2min。5.1.6.3.3在同一井中搀加5uL贾第鞭毛虫囊和5uL隐抱子虫卵囊阳性样本，然后将它放在培养箱中干燥。5.1.6.3.4参照5.1.4.3染色。5.1.6.3.5对整个井面进行计数。必须找到根据表6中描述的规则而均匀染色的抱囊和卵囊5.1.6.4整个程序的质量控制整个步骤（从采样到质量控制显微镜检查）的质量控制应每三个月做一次。它由两个试验组成：分析ZoL加有原虫的水作为阳性对照，分析20L的蒸馏水作为阴性对照。5.1.6.4.1阴性对照A加201蒸馏水到小口塑料瓶中。B与样品分析一样分析蒸馏水。不得找到任何贾第鞭毛虫或隐抱子虫将所有结果记录在表7原虫测定方法质量控制表格中5.1.6.4.2阳性对照为了做阳性对照，应在20l蒸馏水中搀加已知数量的囊和卵囊。用血球计数器和用染色的井形载玻片．测定在201蒸馏水中加人的饱囊和卵囊的数量A原虫接种液的计数涡旋2min储存的原虫。b在一个有10ml蒸馏水的烧杯中加一些抱囊和卵囊，以便得到一个最终浓度大约每ml50000护个抱（卵）囊的溶液。用磁棒搅拌30min。d用血球计数器测定这种溶液的浓度10次e用染色的井形载玻片［加大约250个抱〔 卵）囊到井上」测定这种溶液的浓度5次。计数这两种方法的浓度和标准差。如果标准差小于25 %，那么就可以把这个读数看作是正确的。如果标准差大于25 %，就要制备新的原虫接种液，然后再测定它的浓度。B阳哇对照的分析在装有101，蒸馏水的小口塑料瓶中加500个贾第鞭毛虫的抱囊和500个隐抱子虫的卵囊。b用滤囊过滤该水用10L蒸馏水冲洗小口塑料瓶，然后用同一个滤囊过滤该水。d分析这个样品要象分析一个典型的样品一样将所有结果记录在表7中。这种方法的回收率为10％一100％之间如不在此范围，需检查所有的设备和试剂，同时再做一个阳性对照5.1.6.5免疫灸光质，控制记录原虫测定方法质量控制记录到表7中   

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