原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性的比较

发布时间：2019-08-02 09:34:16 来源：文档文库

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原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性的比较

作者：蔡文虹孙保东张宝凤岳野成文翔李金超虎义平张鹏

来源：《中国当代医药》2012年第20期

[摘要] 目的通过对原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性进行比较，为类风湿关节炎（RA）研究用细胞提供多重选择。方法分离培养原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞，传至第三代，与成熟细胞系镜下观察细胞形态。此外，以相同细胞数接种，观察细胞增殖速度。结果形态上原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞与成熟细胞系有所差别，且增殖速度细胞系快于原代细胞。结论成熟细胞系可在一定程度上反映原代细胞的状态，并用于RA相关疾病研究。

[关键词] 原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞；成熟细胞系；细胞形态；增殖速度

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）07（b）-0008-03

Comparison of the growth characteristics between primary rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes and mature celline

CAI Wenhong1 SUN Baodong1 ZHANG Baofeng2 YUE Ye3 CHENG Wenxiang3 LI Jinchao3 HU Yiping3 ZHANG Peng3

1.Rheumatology Department, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518039, China; 2.Nutrition Department, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518039, China; 3.Translational Medicine R&D Center, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Science, Guangdong Province, Shenzhen 518055, China

[Abstract] Objective To compare the growth characteristics between primary rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes and mature celline to provide multiple choices for RA research. Methods Isolate and culture primary rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells. After three passages cell morphology was observed with microscope. In addition, observe the speed of cell proliferation with the same number of cells inoculated. Results Some differences exist in the cytomorphology and the proliferation speed of celines was faster than primary cells. Conclusion The mature cells can reflect the status of primary cells to some extent, and have application in RA-related diseases research.

[Key words] Primary rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells; Mature cellines; Cytomorphology; Proliferation speed

全世界类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）受累人口众多，患病率为0.5%～1.5%，不同的地域及人群患病率存在一定差异[1-3]。我国RA患病率为0.32%～0.36%[4]。类风湿关节炎至今无法治愈，究其病因，可能与基因易感性、感染、年龄、性别、寒冷潮湿等相关[5]。目前治疗方法众多，有药物治疗、物理治疗、外科手术等，具有一定的缓解作用，但持续时间长，花费昂贵，对个人会造成巨大的经济负担及长期治疗所带来的身心负担。有研究称，RA发病2年后，有1/2～1/3的患者进行正常工作，另外由于治疗RA所投入的大量人力物力，这就同时给社会带来巨大的经济损失[6]。

滑膜异常增生是类风湿关节炎典型的病理特点，造成软骨及骨侵蚀，导致关节功能丧失。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是滑膜组织的重要促成部分，通过分泌各种炎性因子促进炎症发生发展[7]。原代类风湿关节炎FLS是从RA患者关节腔滑膜组织中取材，经过培养扩增，以3～7代进行实验研究[8]。原代FLS材料来源少，所用代次靠前，可研究时间有限。本研究旨在通过对原代RA FLS及成熟细胞系生长特性进行比较，以期为RA研究提供更多实验细胞种类，并为其他相关科学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

成熟细胞系：MH7A，购自日本RIKEN细胞库，编号为RBRC-RCB-1512。

RA 滑膜组织：2例活动期RA滑膜组织取自2011年9～12月期间，诊断均符合1987年美国风湿病学会修订的RA分类标准。滑膜组织的采集得到患者本人或家属知情授权。

1.2 实验器材

超净台（苏净安泰，BSC-1000A2）；台式离心机（环宇，YXJ-1）；倒置荧光显微镜（Leica，DMI3009b）；CO2生化培养箱（三洋，MCO-20AIO）。

1.3 实验试剂

1640培养液（Gibco，C22400，500 mL）：加胎牛血清（Hyclone，SV30087.02）55 mL，青链霉素（Hyclone，SV30010）5.5 mL

DPBS（Hyclone，C4190）；胶原酶（GIBCO，17100-017）；0.25%胰酶（Hycloe，SH30042.01B）。

1.4 实验方法

1.4.1 取材

手术室进行无菌取材后放入不含血清的培养基内，冰上保存，迅速转移至实验室。剔除脂肪及纤维组织，磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗2～3遍，去除血污。将组织反复剪切成约1 mm×1 mm×1 mm的碎块，置于无菌瓶内。

1.4.2 消化及培养

用30倍体积0.5 mg/mL的胶原酶I 37℃消化1～2 h后，离心2次，去除脂肪及杂质。将沉淀悬浮至1640培养液（10%胎牛血清）中置于37℃、5%CO2孵箱内培养。待滑膜细胞70%～80%汇合成片，以2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化细胞，并按1∶6的比例传代。

1.4.3 原代RA FLS与成熟细胞系MH7A生长特性比较

1.4.3.1 形态观察待原代RA FLS传代稳定后，取第3代细胞置显微镜下观察，从细胞形态，密度等方面与MH7A进行比较。

1.4.3.2 增殖速度比较取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化RA FLS和MH7A，用新培养基制成细胞悬液后计数，均按照2×105接种25 cm2细胞培养瓶，观察细胞70%～80%汇合所需时间。

2 结果

2.1 细胞形态观察

培养4 h后，显微镜下观察细胞开始贴壁生长，分布均匀，初为圆型。24 h后观察，细胞生长状态良好，分离培养的原代RA FLS细胞呈现长梭形（图1和图2）。随着细胞不断分裂，增殖，逐渐增多，细胞相互接触交织成网状。MH7A与原代RA FLS 形态上差别较大。MH7A呈三角形或不规则形，细胞易聚集成堆生长，且漂浮死细胞较多（图3）。

2.2 增殖速度比较

均按照2×105接种后，对2种细胞增殖速度进行记录比较。原代RA FLS到达 70%～80%汇合所需时间为4～5 d，而MH7A所需时间明显缩短，为2～3 d。

3 讨论

研究表明，FLS介导了关节破坏，在RA发病过程中起着至关重要的作用，因此FLS的研究也逐渐受到重视[9-10]。本研究中分离培养的原代RA FLS细胞为规则长梭形，与成纤维样细胞形态相符。且未见其他形态细胞，说明3代后细胞纯度较高。以原代分离培养的RA FLS为研究对象，可能更加贴近病患体内状态，但原代细胞来源有限，使用代次有限，给科学研究带来一定的困难。MH7A作为成熟细胞系，细胞形态有所改变，但增殖速度快，不受代次限制，也不失为RA相关疾病研究理想的实验材料来源。MH7A也存在一定局限性，正因其为细胞系，某些生物学特性可能发生改变，且无法反应原代细胞样本所代表的患者之间的个体差异。综合各因素，MH7A可作为RA相关疾病前期研究的理想材料，一定程度上反应RA FLS的各项指标。

对于FLS的特异分子标志尚无统一定论，但目前有些学者认为FLS细胞表面存在UDPGD， VCAM-1/CD106， DAF/CD55， cadherin -11（Cadherin-11），Vimentin，Thy-1/CD90， proline hydroxylase，CD44等强阳性表达，可作为鉴别细胞种类的分子标志[11-12]。细胞在传代过程中表面分子标志表达可能发生变化，本研究下一阶段计划检测原代FLS和细胞系表面分子标志差异，以及对RA治疗药物的不同反应。此外，绘制原代RA FLS和MH7A生长曲线，以更精确反应二者增殖速度上的差别。全面了解FLS原代及细胞系生物学特性的差异，为FLS在RA疾病中的深入研究和应用奠定基础。

[参考文献]

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[2] Neil Betteridge. Services For People With Rheumatoid Arthritis-International Comparisons[R]. London：National Audit Office，2009.

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[6] WHO. The Global Burden of Rheumatoid Arthritis in the year 2000[EB/OL]. [2011-11-10]. http：//www.who.int/healthinfo/statistics/bod_rheumatoidarthritis.pdf.

[7] Yamanishi Y，Firestein GS. Pathogenesis of rheumatoid arthritis：the role of synoviocytes[J]. Rheum Dis Clin North Am，2001，27（2）：355-371.

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