实验三 Trizol法提取细菌总RNA
一、实验原理
Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织,Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
二、主要试剂和器材
Trizol 溶液 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水
超净工作台 2.0 mL离心管(无Rnase) 移液枪 紫外分光光度计
石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌
三、实验步骤
(一). 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA
1. 挑取大肠杆菌菌单菌落,培养至稳定期,取菌液 2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体;
2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液,盖紧管盖,激烈振荡15 s,室温静置5 min 4℃,12000 g,离心 10 min;取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中;
3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol),盖紧盖,剧烈振荡 15 s;室温静置 3 min;4℃, 12000 g, 离心 10 min;小心吸取上层水相,转入另一新的 2.0mL 离心管,测量其体积;(加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。)
4、 加入1倍体积的氯仿,盖紧盖,剧烈振荡 15 s;室温静置 3 min;4℃,12000 g,离心 10 min;小心吸取上层水相,转入另一已编号新的 2.0mL 离心管;
5、 加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol),轻轻颠倒混匀;室温,静置 10 min;4℃,12000 g,离心 10 min,RNA 沉于管底;小心吸去上清;
6、加1 mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒,洗涤沉淀;4℃,7500 g,离心 5 min;
小心弃上清,微离,吸去剩余乙醇,室温干躁 10 min;
7、 各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解,55-60℃温育5 min,分装,-80℃贮存(可贮存5周);
(二). RNA 浓度的测定
取 10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL,转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中,小心排除气泡,以等体积的双蒸水作为空白对照,在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值,根据公式计算 RNA 的浓度。
RNA 浓度(µg/µL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(µg/mL)/1000
纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.8~2.0,若低于该值,表明存在蛋白质污染,可重新用酚∕氯仿抽提。该值为 2.0 时,RNA 纯度为最高。
(三). RNA 质量检测
将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测,目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为,如果 23 S和16 S 条带明亮、边缘清晰,并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上,则 RNA的质量较好。
(1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具,水平放置在工作台上;
(2) 准确称取 0.15 g琼脂糖加入 15 mL 1 × TAE 中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 2 min),待冷却至60℃时,加入 EB(终浓度为 µL/mL),充分混匀;
(3) 插入适当的梳子,将温热的凝胶倒入胶模中,凝胶厚度为 3~5 mm,置于室温下凝固;
(4) 待凝胶凝固后,小心移去梳子,将凝胶置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,使液面高出凝胶 1~2 mm;
(5) 用微量移液器将样品8µL与上样缓冲液2µL混合并将混合液小心加入上样孔内,同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照(2000bp);
(6) 盖上电泳槽盖,调节电压 100 V,电泳 15min 左右;
(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果,用凝胶成像系统照相保存。
四、注意事项
1. RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1% DEPC浸泡过夜后,高压蒸气灭菌)。用于RNA实验的试剂,须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装,使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。
2、提取时操作带一次性手套、口罩等,小心、细致、晃动及每次移液要轻;在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个,一是小心RNAse的污染降解RNA;二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。
3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先进行处理。
4. 一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳,但是一般的琼脂糖电泳也可以,需要上样量稍微大些,并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解),跑完电泳立刻观察。
5、需要用EB染色,Genefinder染色效果不好,其对双链DNA的效果好。
6、器材的处理:尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理。
(1) 用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。
(2) 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
RNA实验用的器具建议专门使用,不要用于其它实验。
本文来源:https://www.2haoxitong.net/k/doc/7768c22abcd126fff7050bea.html
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