产胞外淀粉酶的菌株的筛选以及酶活力的测定
一：实验原理
异养型微生物在生存的时候，自己不能产生可以供机体使用的能源物质。所以必须从体外获取这些能源物质。某些异养型的微生物可以利用淀粉作为能源物质将其分解为葡萄糖让自己利用。但是淀粉作为大分子的物质不能直接进入微生物的体内直接将其分解。所以某些微生物会产生胞外淀粉酶，将自己周围的淀粉分解为葡萄糖。再葡萄糖进行吸收利用。本实验就是筛选出一种产胞外淀粉酶的高效菌株，并对其产生的胞外淀粉酶的酶活力进行初步检测。
二：实验器材，试剂
1样品：发霉的面包，富含淀粉的土壤，
2仪器：离心机，试管，紫外分光光度计，三角瓶，摇床，分析天平，定量移液器，药匙，培养皿，恒温水浴锅，恒温培养箱，超净工作台，接种环，接种针，酒精灯，高压灭菌锅，直尺，移液管，洗耳球。
3试剂：碘固体，DNS（3，5－二硝基水扬酸），1mg/ml的麦芽糖溶液，1%的淀粉标准溶液，PH为5.5的柠檬酸缓冲液。
4培养基：淀粉培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，PH7.0。
种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0。
产酶培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0。
三：实验步骤
1：初筛①若样品为富含淀粉的土壤，则称取土壤样品10g放在盛有90ml无菌水和8颗小玻璃珠的三角瓶中，放置在摇床上震荡30min后再进行七次梯度稀释，分别取第4,5,6,7次梯度稀释后的稀释液各1ml进行初步培养。所用的培养基为淀粉培养基。在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
②若样品为发霉的面包，则用接种环或接种针挑取部分的霉块。将挑取的霉块浸泡在装有10ml无菌水的试管里震荡1min进行稀释。取1ml稀释液进行初步培养。所用培养基为淀粉培养基。在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
2：鉴定采用碘熏蒸法将0.04g碘轻轻洒在培养皿盖上后，将装有培养基的培养皿底部倒置在撒有碘的培养皿盖上进行碘熏1min。选透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比最大的初选菌株。
3：复筛将初选菌株接入装有种子培养基的三角瓶中，在37℃条件下摇床震荡培养16h，以2%接种量接入产酶培养基，相同条件培养36-48h。【种子培养基和产酶培养基的规格和装液量为200ml的三角瓶装50ml的培养基。】
4：酶活力的测定 ①样品酶活力的测定
（1）从产酶培养基中取4.5ml的菌液转移至离心管中，12000rpm离心30s。
（2）用定量移液器取离心处理后的上清液0.5ml，5ml 1％的淀粉溶液和1ml的柠檬酸缓冲液于试管中然后37℃水浴5min，接着沸水浴5 min，终止反应，再加入2 mL的DNS，沸水浴5 min后，迅速冷却，加蒸馏水5 mL，于 520 nm处测其吸光度 A值。（在反应时间不超过5min，底物浓度的变化不超过初始浓度的5%时，产物产量与时间几乎成正比关系。）
（3）以上清液0.5ml加5ml1％淀粉直接煮沸再加 1ml的柠檬酸缓冲液，2ml DNS试剂，5ml蒸馏水反应作为空白对照。
酶活力单位以1ml发酵液中存在的淀粉酶在1min内催化淀粉生成1umol还原糖为1个酶活力单位（IU的量纲为umol/min）。
②麦芽糖标准浓度曲线的制作：
取8支试管预先洁净灭菌干燥编号，按下表加入试剂，摇匀，至沸水浴中煮沸5min，取出后迅速冷却，再加入16ml蒸馏水。以1号管最为空白调零点在520nm的波长下比色测定吸光度并建立麦芽糖浓度的标准回归方程。
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V粗酶液×T反应时间
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/75491847c950ad02de80d4d8d15abe23482f03a4.html
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