DOX

DOX

 作者：张世睿，王禾，秦卫军，刘贺亮，温伟红

【关键词】  肾癌细胞

    Cytotoxicity of DOXGA3 to βglucuronidase  cDNA transfected human renal carcinoma GRC1 cells in vitro

　【Absract】 AIM: To establish a renal carcinoma model with high expression of βglucuronidase  (βG) and to observe the killing effect of βGprodrug N［4DOXorubicinNcarbonyl(oxymethyl)phehyl］Obetaglucuronyl carbamate (DOXGA3) on βG cDNA transfected human renal carcinoma GRC1 cells in vitro. METHODS:  A eukaryotic expression vector (+)βG was transferred into renal carcinoma GRC1 cells with lipofection reagent and the βG vectorproducer cell line GRC1/βG was isolated in 1000 mg/L neomycin medium. It was confirmed by genomic  PCR, immunofluorescency and immunohistochemistry. The cytotoxicity and bystander effect were estimated by MTT and trypan blue exclusion test. RESULTS:  βG gene was stably integrated into the genomic DNA of the GRC1 cell and got a high expression. The DOXGA3, with the concentration of 100 μmol/L for 3 d, had little effect on parental cells, with a survival rate of 82%. However, it killed all the transfected cells. When IC50 GRC1/βG was μmol/L, IC50 GRC1 was more than  more than 100 μmol/L, and the GRC1/βG cells were mixed with parental cells with various proportions, the GRC1/ βG cells accounted for 20%, 80% of the mixed cells were killed. CONCLUSION:  We have successfully established the renal carcinoma model with high expression of βG gene. DOXGA3 has obvious cell killing effect on the GRC1/βG, which is strengthened with the rising concentration and the prolonging time, and potent bystander effect.

　　【Keywords】 βglucuronidase; renal carcinoma cell; transfection; suicide gene therapy; prodrugs; bystander effect

　　【摘要】 目的： 建立高表达β葡萄糖醛酸苷酶（βG)基因的肾癌模型，并观察βG前体药葡萄糖醛酸化阿霉素（DOXGA3）对βG转染人肾癌GRC1细胞的体外杀伤作用. 方法： 利用阳离子脂质体将已构建的真核表达载体(+)转入肾癌细胞株GRC1,用基因组PCR扩增，免疫荧光，免疫组化检测鉴定其转录和表达水平，分别用MTT及细胞计数法检测βG阳性细胞对DOXGA3的体外敏感性和旁观者效应. 结果： 经G418筛选后的阳性细胞克隆，在DNA和蛋白水平证实了转染细胞内有βG基因高表达，100 μmol/L DOXGA3作用于亲本细胞3 d，生存率为82%，但可杀死全部转染细胞，IC50GRC1/βG为 μmol/L,而IC50GRC1为100 μmol/L以上，将转染细胞和亲本细胞以不同比例混合时，转染细胞占20%，有80%的细胞被杀死. 结论： 建立了稳定的βG基因高表达的肾癌模型. DOXGA3对转染细胞有明显的杀伤作用，随时间延长和剂量增加作用增强，并显示较强的旁观者效应.

　　【关键词】 β葡萄糖醛酸苷酶；肾癌细胞；转染；自杀基因治疗；药物前体；旁观者效应

　　0引言

　　肾癌是泌尿系统常见肿瘤，对于术后或失去手术指征的患者进行基因治疗成为肾癌治疗新的热点. β葡萄糖醛酸苷酶（βG)能特异地水解葡萄糖醛酸苷的糖苷键，释放出葡萄糖醛酸和配基. 受自杀系统HSVTK/GCV和ECCD/5FC系统的启发，参考国内外将βG基因引入肿瘤的基因治疗的最新报道［1］，我们研究βG及其前体药葡萄糖醛酸化阿霉素（DOXGA3）对肾癌细胞的作用.

　　1材料和方法

　　材料

　　人肾癌细胞系（GRC1）由北京大学泌尿外科研究所田龙博士惠赠. 质粒(+)及含人βG全长cDNA的真核表达载体(+)βG由我院泌尿外科秦卫军博士惠赠. 脂质体（lipofectaminetm reagent）购于美国Gibco公司，抗βG兔抗人抗体和FITC标记羊抗小鼠IgG为洛阳华美生物技术公司产品，DOXGA3购自美国罗氏制药公司.

　　方法

　　在6孔培养板中，分别加入处于对数生长期的GRC1细胞1×106个，分别加入含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液，按梯度分别加入100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400 mg/L的新霉素（neomycin），37℃, 50 mL/L  CO2中培养21 d. 观察并确定细胞全部死亡时所需的最低新霉素含量. 参照Gibco公司和lipofectin reagent药盒说明进行，将(+)βG, (+)质粒分别转染GRC1细胞，经转染72 h后G418筛选3 wk，挑选抗新霉素阳性克隆，

传代，G418维持培养按常规（细胞培养，西安，世界图书出版社，1994）进行. GRC1/βG细胞的鉴定包括：① 基因组PCR鉴定；② βG在细胞内表达的免疫荧光检测； ③ βG在细胞内表达的免疫组化检测.

　　选取处于对数生长期的GRC1/βG细胞,转染空载体的GRC1/（+）及亲本细胞GRC1，胰蛋白酶消化后，调整细胞密度，分别接种于96孔板，1×104细胞/孔.  细胞贴壁后，加入DOXGA3（~100 μmol/L）的新鲜培养液, 每个浓度设5个平行孔, 以不加DOXGA3的细胞为对照, 48 h时换液1次，培养72 h. 用MTT法测定细胞存活率： (实验组各孔的平均A值/相应的对照孔的平均A值)×100%. 以计量为横轴，细胞存活率为纵轴绘制剂量效应曲线，进行统计学处理，求出各细胞的IC50，按下式计算治疗指数（therapeutic index）： (未转染细胞IC50/βG阳性细胞IC50)×100%. 另选取对数生长期的GRC1/βG细胞，消化成单细胞悬液，接种24孔板，3×104细胞/孔, 共接种4块. 2 h后，待细胞贴壁后，参考DOXGA3杀伤的剂量依赖性结果，换以分别含, 1和10 μmol/L DOXGA3的新鲜培养液. 2 d换液1次. 从加DOXGA3当日起，每日每浓度取3孔以4 g/L胎盘兰排斥法计数活细胞；以时间为横轴，以存活细胞数为纵轴，绘制时间―效应曲线. 另取对数生长期的GRC1/βG及其亲本细胞GRC1，分别用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按βG阳性细胞所占的不同的比例（100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10%, 0）将2种细胞充分混合，以每种比例接种10个平行孔接种96孔板，4×103细胞/孔. 次日，待细胞贴壁后，给每个比例的其中5孔加入含 μmol/L DOXGA3的新鲜培养液，另外5孔加入不含DOXGA3的新鲜培养液，培养6 d，2 d换液1次. 第6日, 各孔细胞用胰蛋白酶消化，用MTT法测定细胞存活率， 以未加DOXGA3的各组细胞的细胞数为100%对照, 计算各比例的细胞存活率. 以βG阳性细胞的比例为横轴，以细胞存活率为纵轴绘制直方图.

　统计学处理： 数据以x±s表示，应用软件，组间比较使用非参数秩和检验，P<为有统计学差异.

　　2结果

　　细胞转染及筛选结果在6孔板上可见当新霉素（neomycin）浓度≥1000 mg/L时，所培养的GRC1细胞于1 wk内全部死亡；而当浓度低于1000 mg/L时，2 wk内部分GRC1细胞死亡. 选定新霉素筛选浓度为1000 mg/L. 从筛选的第2日起，各组细胞即开始有细胞皱缩、漂浮，失去折光性. Ⅰ, Ⅱ组细胞在G418筛选的第7日全部死亡. Ⅲ组细胞在筛选过程中也不断地有死亡，在筛选的第14日即有小的抗性克隆形成；继续维持筛选，待小克隆逐渐长大后，用滤纸片法将克隆转移至24孔板扩大培养. 以提取的GRC1/βG细胞及GRC1, (+)空载体细胞的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，见GRC1/βG细胞可扩增出约 kbp大小的产物，与预期结果相同；而GRC1和(+)空载体对照组均未扩增出产物. 证实GRC1/βG细胞整合了(+)βG基因（Fig 1）. 以抗βG抗体为一抗，羊抗兔/FITC为二抗结合反应后，荧光显微镜观察GRC1/βG胞质内可见亮绿色荧光，胞核内亦有分布；而GRC1细胞质内仅见较弱荧光（Fig 2A,B）. 对爬片细胞进行免疫ABC法染色，结果GRC1/βG转染细胞可见棕色颗粒，主要分布在胞质内， GRC1细胞则均呈阴性 （Fig 3A,B）.

　　对GRC1/βG细胞杀伤的剂量依赖性用MTT比色法检测不同浓度DOXGA3作用72 h对GRC1/βG细胞存活的影响,以转染空载体的GRC1/（+）及未转染的亲本细胞GRC1为对照，发现DOXGA3对未转染的细胞毒性很小，100 μmol/L DOXGA3作用于GRC1细胞3 d,存活率仍为82%，作用于转染空载体细胞，生存率为80%，而大于 μmol/L的DOXGA3即可明显抑制转染细胞的生长, 随DOXGA3浓度加大，GRC1/βG细胞的存活率大幅度降低，呈现明显的剂量依赖性： 在1 μmol/L DOXGA3作用下, 约有60%的细胞存活, 10 μmol/L时存活率只有20%, 100 μmol/L 时βG转染细胞全被杀死，显示出明显的“自杀效应”. 以IC50代表细胞对DOXGA3的敏感性来进行对比可见，GRC1细胞尽管没有确切的IC50值，但肯定大于100 μmol/L； 而高表达βG的GRC1/βG细胞IC50只有 μmol/L, 对DOXGA3的敏感性比亲本细胞提高了80倍以上, 治疗指数大于80，获得较宽的治疗范围.

　　 对GRC1/βG细胞杀伤的时间依赖性分别用含, 1和10 μmol/L的 DOXGA3作用GRC1/βG细胞，每日计数存活细胞, 直至全部细胞死亡. 结果随DOXGA3作用时间的延长，GRC1/βG细胞的存活率逐渐降低，呈明显的时间依赖性： 10 μmol/L DOXGA3在4 d内即可将细胞全部杀死，而 μmol/L的DOXGA3杀死全部的细胞需要6 d, μmol/L则需要9 d. 

　　βG及其前体药系统对肾癌细胞作用的旁观者效应 μmol/L DOXGA3作用混合细胞6 d， 结果可见，随着GRC1/βG细胞比例的逐渐增加，存活细胞百分比逐渐降低（P<, Fig 4）.

　　3讨论

　　自杀基因疗法，又称药物敏感基因疗法，是生物治疗的主要方法之一，它是采用转基因方法，将哺乳动物中不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内，由于该基因表达的产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物，影响细胞的DNA合成，从而引起该细胞死亡，达到清除肿瘤细胞的目的. HSVTK/GCV和ECCD/5FC系统是最常用的2种分子化疗. βG是人体重要的酸性水解酶，具有参与机体的生理、病理及药物代谢等功能，它能特异地水解葡萄糖醛酸苷的糖苷键，释放出葡萄糖醛酸和配基. 仇凯等［2］报道了人工合成葡萄糖酸化表阿霉素（Epibus）作为βG前体药的例子，除了Epibus以外，具有代表性的药物还有葡萄糖醛酸化的柔红霉素 DNRGA3［3］,葡萄糖醛酸化的阿霉素DOXGA3［4］等. 我们用脂质体介导法将含βG基因的真核表达载体导入肾癌GRC1细胞中，经G418筛选2 wk，获得了具有G418抗性的细胞克隆，体外扩大培养后，提取细胞DNA行PCR扩增检验，同时我们又进行了免疫荧光、免疫组化的检测. 结果显示筛选出的克隆高表达βG，在蛋白水平验证了βG基因不但转入细胞，而且经转录、翻译，显示出较高的表达水平，将转染的细胞克隆命名为GRC1/βG. 转染细胞对DOXGA3的敏感性比亲本细胞提高了8

0倍以上，且随着作用剂量的增加和作用时间的延长，DOXGA3对转染细胞的杀伤作用在增强，体现了时间依赖性和剂量依赖性.当GRC1/βG细胞只占20%的时候, 混合细胞约有80%的细胞被杀死，显示较强的旁观者效应，由于目前基因治疗面临的主要问题是体内转染效率低下. 旁观者效应的存在很大程度上弥补了这个不足. 本研究为βG基因与βG前体药系统治疗肾癌尽早进入临床应用提供了理论及实验依据.

　　【参考文献】

　　［1］ Farquhar D, Pan BF, Sakurai M, et al. Suicide gene therapy using betagalactosidase ［J］. Cancer Chemother Pharmacol, 20XX;50(1):65-70.

　　［2］ 仇凯，张立红，金晶，等.  RPHPLC制备葡萄糖醛酸前体药葡萄糖醛酸化表阿霉素及其代谢产物［J］. 第四军医大学学报，20XX；21（1）：113-115.

　　Qiu K, Zhang LH, Jin J, et al. Preparation of  Bglucuronidase prodrug epirubic in metabolite from epirubic in pretreated patien turine by reversedphase high performance liquid chromatography ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 20XX；21（1）：113-115.

　　［3］ Fonseca MJ, Jagtenberg JC, Haisma HJ, et al. Liposomemediated targeting of enzymes to cancer cells for sitespecific activation of prodrugs: Comparison with the corresponding antibodyenzyme conjugate ［J］.  Pharm Res, 20XX;20(3):423-428.

　　［4］ Houba PH, Boven E, ven der MeulenMuileman IH, et al. Pronounced antitumor efficacy of DOXorubicin when given as the prodrug DOXGA3 in bination with a monoclonal antibody betaglucuronidase conjugate ［J］. Int J Cancer. 20XX;91 (4):550-554

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/6d28bcadabea998fcc22bcd126fff705cd175cd2.html