家畜繁殖学实习报告（云南农业大学）

云南农业大学

家畜繁殖学实习报告

学 院： 动物科学技术学院

专 业： 动物科学

年 级： 2010级

学生学号： 2010310725

学生姓名： 陈江明

指导教师： 哈福

实习地点： 云南农业大学动物遗传育种与繁殖实验室

日 期： 2012年7月15日

实习报告

（云南农业大学动物科学技术学院 陈江明 2010310725）

一、实习目的

掌握种畜精液品质检查方法，熟悉检查程序，学会药品的配制方法，为以后从事畜牧生产打下坚实的基础。

二、药品和仪器

药品：氯化钠、苯胺黑、伊红、氯胺T、美蓝（甲基蓝）、乙醚、无水乙醇、95%乙醇、复红、苯酚（石炭酸）、氢氧化钾、苏木精硫酸铝钾、冰醋酸、二水磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、40%福尔马林液、十二水磷酸氢二钠、甲醛、碳酸镁、Giemsa原料、甘油、甲醇、香柏油、蒸馏水。

仪器：小试管、50ml容量瓶、100ml容量瓶、500ml容量瓶、1000ml容量瓶、试管架、显微镜、载玻片、盖玻片、水浴恒温箱、温度计、量筒、胶头滴管、大烧杯、小烧杯、染色用玻璃板、医用胶带、镊子、酒精灯、毛细玻璃管、pH试纸、移液枪（1ml、10ul）、电子天平、称量纸、药品勺、滤纸、漏斗、标签纸、玻璃棒、移液管、血细胞计数器、纱布、药棉、研钵。

三、试剂配制

3%氯化钠溶液：称取30g氯化钠，在烧杯中溶解并定容于1000ml容量瓶中。

1%氯化钠溶液：称取10g氯化钠，在烧杯中溶解并定容于1000ml容量瓶中。

0.9%氯化钠溶液：称取9g氯化钠，在烧杯中容解并定容于1000ml容量瓶中。

5%伊红溶液：取2.5g的伊红（曙红），用蒸馏水配制成50ml的伊红溶液。

1%苯胺黑溶液：取0.5苯胺黑（阿尼林黑、精元），用蒸馏水配制50ml的苯胺黑溶液。

0.1mg/ml美兰溶液： 取美兰100mg，溶解于100ml的1%的NaCl溶液中，置于容量瓶中3d，再用1%氯化钠溶液稀释10倍备用。

复红原液：称取10g复红（品红）溶于100ml 95%的酒精中。

5%石炭酸溶液：称取5g苯酚溶于100ml 蒸馏水。

饱和伊红酒精溶液：量取60ml 95%酒精于烧杯中，加入伊红不断搅拌，直至伊红不再溶解为止。

复红染色液：取复红原液10ml、5%石炭酸溶液100ml相互混合，然后再加入饱和伊红酒精溶液50ml 混合，放置两周后即可使用。

美蓝溶液：取1g美蓝溶于100ml 95%酒精中。

0.01%氢氧化钾溶液：取0.1g氢氧化钾用蒸馏水定容至1000ml。

美蓝染色液：取美蓝溶液30ml、0.01氢氧化钾溶液100ml混合，然后过滤并加入3倍量的蒸馏水，混合后即可使用。

0.5%氯胺T：取氯胺T0.5g溶于100ml蒸馏水中。

苏木精溶液：苏木精2g、冰醋酸10ml、甘油100ml、95%酒精100ml、蒸馏水100ml、硫酸铝钾5g。

1.将苏木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后搅拌。

2.加入甘油及其余酒精。

3.研碎钾矾溶于水并加温。

4.将其一滴滴加入染色剂中，并不断搅动。

5.瓶口用双层纱布包扎，放于通风处，并经常摇动，颜色变为紫色时方可使用。如

果加入0.2g碘酸钾即刻成熟。

使用时，原液：50%酒精和等量冰醋酸混合液为1:1混合。

伊红染液：取1g伊红溶于100ml 95%酒精中，染色时，取一定量的该液加入等量70%的酒精。

福尔马林缓冲液：将21.82 g Na2HP04·2H20和22.25 g KH2P04分别溶于500 ml蒸馏水中，然后取 200 ml Na2HP04 加80 ml KH2PO4配成缓冲液。再取该缓冲液100 ml加入62．5 ml 40%（v/v）福尔马林溶液，最后加蒸馏水至500 ml。

磷酸盐缓冲液：取Na2HPO4·12H2O 2.2 g、NaH2PO4·2H2O 0.55 g，先用少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至100 ml。配制后用pH试纸测pH值，应为7.0～7.2。

福尔马林磷酸盐固定液

1.Na2HPO4·12H2O 2.25g、NaH2PO4·2H2O 0.55g置于100 ml烧杯中，加入0.89％NaCl溶液约30 ml，使之溶解。

2.加入甲醛MgCO3饱和液8ml。

甲醛MgCO3饱和液配制方法：在500 ml福尔马林（40％甲醛）中加入8 g MgCO3。此饱和液必须在一周前配好。

3.用0.89％NaCl溶液少许冲洗装过甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100 ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室温下保存，其pH 为7.0～7.2。

Giemsa原液：按1 gGiemsa原料：66 ml甘油：66ml甲醇的比例配制。将Giemsa染料置于研钵中，先加入少量温热（60℃）的甘油，充分研磨至无颗粒呈浆糊状。再将剩余甘油全部倒入，置56℃恒温箱中保温2小时。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一个月后才能使用。此原液放置时间越长越好，但使用前需经过滤。

Giemsa染液（必须在染色前配制）：按Giemsa原液 : 磷酸缓冲液 : 蒸馏水的比例为2 : 3 : 5的比例配制。

四、实习内容

（一）肉眼观察

猪精液稀薄，灰白色，无云雾状现象。

（二）精子密度的检查及活率评分

评定精子的活率在25℃下（在37℃保温箱内或加热在舞台最佳），用玻璃棒取一

滴原精液或稀释精液滴在载玻片上，盖上盖玻片，其内无气泡、充满精液，在油镜下，暗视野中观察。

备注：稀释时，用等温的0.9%NaCl溶液稀释；标准是直线运动精子的比例。

（三）死活精子百分率的测定

1.方法 各取5ml的5%伊红和1%苯胺黑按1:1混匀，分装于1—2ml的容量试管中，约为容量的1/2，在37℃水浴，随后加1—3滴原精，摇匀，水浴3min，取出待用。用火柴棍沾一滴混合液于载玻片一端，考另一端推进制成抹片，干燥，在500—600倍下观察。（制抹片，在35℃—40下，快速）

2.结果 活精子头部不着色，死精子头部呈红色，苯胺黑为背景染色，容易辨别，数200个或500，，分别数出活精子和死精子，并计算。

（四）精子呼吸强度的测定

1.原理 由于精子呼吸消耗精液中的氧，氧耗尽，美蓝退色，美蓝遇氧时又恢复其蓝色，其反应机制是由于精子脱氢酶的作用，脱去糖原上的氢原子，在无氧条件下，氢原子与蓝色的甲烯蓝结合变成甲烯白。因此，实际上也是测定精子脱氢酶活性的一种方法。其呼吸强度与美兰退色时间呈负相关。

2.方法 取一滴美兰与精液于载玻片上，混匀。吸入两段毛细管2—3cm，两段分别

置于37℃、10℃条件下，用计时器记录时间，并比较、观察。

（五）精子密度的计数检查

1.将计数室推上盖玻片。推上后立起计数板不掉下来为原则，盖玻片在折光时可见清晰的彩色条纹。

2.将盖好盖玻片的计数板置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。

3.用移液枪吸取1ml 3%氯化钠溶液于小试管中，再用移液枪吸出10ul氯化钠溶液，同时加入10ul 猪精液，即进行一百倍稀释，摇匀。

4.用吸管吸取稀释后的精液，并将吸管尖端置于血细胞计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地分充满计数室。不要溢出和有气泡，静放2min。

5.移到高倍镜下检查，数出四角和中央方格中的精子数，也就是80个小方格中的精子数，载物台要平置。

6.计算精子数 1ml=原精液内的精子数=5个中央方格数的精子数×5×10×1000×稀释倍数。

7.吸管用后清洗，步骤：自来水—蒸馏水—95%酒精—乙醚。

8.计数板用后清洗，步骤：自来水—蒸馏水—白绸布擦干净备用。

（六）精子头部形态的观察（威廉氏染色法）

染色程序：

1．先制作精液抹片，要求薄而均匀。然后风干或用酒精灯火焰固定。

2．浸入无水酒精中固定2~3 min，取出风干。

3．浸入0.5％氯胺T中l~2 min。

4．用清水洗1~2 min。

5．迅速通过96％的酒精，风干。

6．放人石碳酸复红染色液中l0~15 min，然后清水中蘸2次。

7．迅速通过美蓝染色液。

8．水洗后风干。

经此方法染色后，精子头部呈淡红色，中段及尾部为暗红色，头部轮廓清晰。可在高倍镜或油镜下观察200个精子计算出各类头部畸形精子的比例。

畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100%

（七）非精子有形成分的观察（采用苏木精—伊红染色法）

非精子有形成分多为精子形成过程中的某些退化物、生殖上皮的脱落物和血细胞等。这些成分在精液中出现的比例和类型在一定程度上能反映睾丸和精液排出管道的生理状态。在精液中经常出现的非精子有形物有白细胞、红细胞和鳞状上皮细胞等。

染色程序：

1. 先制备间断式的精液抹片（即当推制抹片时，不要一推到底，而要断续前推，使抹片厚度有一个梯度变化，染色后易于观察不同类型的精子成分），然后风干。

2. 浸入无水酒精中固定3~5 min，风干。

3. 分别浸入95％的酒精、75％的酒精和蒸馏水中各1 min。

4. 浸入苏木精染色液中5 min。

5．浸入伊红染色液中 l min。

6．冲洗1~3 min。

7．通过70%酒精和无水酒精，风干。

8．风干后用二甲苯加盖玻片封存，如不保存可直接观察。

（八）精子尾部形态观察

观察程序：

1．l ml玻璃管中装入一些福尔马林缓冲液，置于37℃恒温箱中备用。

2．根据原精液的浓度，向装有福尔马林缓冲液的小玻璃管中滴2~5滴精液并混匀。

3．取一滴上述混合液置于载玻片上，加盖玻片静止数分钟后在400倍的相差显微镜下观察精子尾部形态。随机观察200个精子计算各种尾部畸形精子所占的比例。

畸形精子百分率＝畸形精子数/总精子数×100%

（九）精子顶体染色观察

先准备洁净的载玻片。用洗涤灵擦洗，清水冲洗，再用蒸馏水漂洗以不挂水珠为净，烘干或晾干备用。

1.抹片 将需测定的样品摇匀，取1滴中层精液平滴于载玻片的右端，取一块盖玻片，呈35°角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在载玻片和盖玻片接触的边缘之间。将上面的盖玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着精液均匀地涂抹在载玻片上。切忌直接将精液滴“推”过去，人为造成精子损伤。在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号。每份精液样品需同时制作两个抹片。

2. 风干 自然风干5~20 min。

3. 固定 将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1 ml固定液滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面，静止固定15 min。

4. 水洗 用玻片镊夹住抹片一端，将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边待干。

5. 染色 将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2 ml，置于要染的玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上，静止染色90 min。

6. 水洗 用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再换装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边待干。

7. 将精液染片置于显微镜下，先用低倍镜找到精子，再换1 00倍下进行油镜观察。精子顶体呈紫色，包围精子头前部。

根据精子顶体完整和损伤与否，将精子顶体形态分为4种类型：

顶体完整型 精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。

顶体膨胀型 顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞膜不明显或缺损。

顶体破损型 顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色浅且不均匀，头前部边缘不整齐。

顶体全脱型 精子顶体全部脱落，精子核裸露。

根据以上4种类型分别统计，观察200个精子，并计算出精子顶体完整率。

精子顶体完整率＝顶体完整型精子数/精子总数×100％

要求2张抹片精子顶体完整率差异不超过15％，求二者平均值。

五、实习总结

通过本次实习，对种公猪精液的品质检查内容、程序和方法有一定的了解和掌握，同时对其他家畜的精液品质检查也有一定的认识和了解，这对我们以后从事畜牧生产，尤其在种公畜精液的品质检查有一定的知识积累，为畜牧生产打下了基础。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/6681a9156c85ec3a87c2c5cd.html