组织培养技术

第五章 组织培养技术

第一节 植物组织培养

所谓植物组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义上是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也包括在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植株。

一、概述

（一）概念

1.植物组织培养：是指通过无菌操作，把植物的外植体接种于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。

2.外植体：是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。

3.愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

（二）组织培养类型

1.根据接种的外植体不同分：胚胎培养 ；器官培养 ；3组织培养 ；细胞培养 ；原生质体培养；

2.根据培养基态相不同分：固体培养； 液体培养；

3.根据培养过程不同分：初代培养；继代培养；

（三）植物组织培养历史

植物组织培养是20世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的。有以下过程：思想准备阶段；理论奠基阶段；技术建立阶段；形态发生阶段；应用研究阶段；

1902年德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性概念。

1939年White报道了烟草组培成功。并提出植物细胞全能性学说。同年，Gautheret与Nobecourt 培养胡萝卜成功。三人被誉为植物组培奠基人。

罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一

（四）植物组织培养的应用

⒈植物的快速繁殖：

⑴园艺、花卉植物的大规模快速繁殖；

⑵抢救濒危珍稀植物

⑶进行某些植物的种质资源保存

⒉培育无病毒的植物，如脱病毒草莓等；

⒊制造人工种子。

4突变体的筛选培育

5药用植物的工厂化生产

6花药培养和花粉单倍体育种

7基因工程的应用等

二、实验室设计和设备

（一）实验室设计 一般具有：

1.准备室 器皿洗涤，培养基配制、分装、高压灭菌，植物材料的预处理，重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析等各种操作都要在此室中进行 .

2.缓冲室 进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌 。

3.无菌操作室也称接种室 。 主要有超净工作台、空调机、医用小平车等

4.培养室 具备适宜的温度、湿度、光照、通风等条件。有培养架子和灯光；通风设施 ； 边台 ；

5.驯化室和温室

（二）常用设备

1．超净工作台

2.无菌箱

3．空调机

4．除湿机

5．恒温箱 又称培养箱

6．烘箱

7．高压灭菌器

8．冰箱

9．天平

10．显微镜

11．摇床或转床

12．酸度计 等

（三）器皿用具

1、培养器皿 器皿按材料分：有玻璃器皿与塑料器皿两种；按其形状分：主要有试管、三角瓶、圆形培养瓶和培养皿L型管和T型管等

2、分注器

3、离心管

4、移液管

5、细菌过滤器

6、器械用具 ：镊子、剪刀、

接种工具、大解剖刀等

7、实验器皿

三、 培养基及其配制

（一）培养基的种类 ：

1.根据态相不同分为：

固体培养基与液体培养基

2.根据培养过程分为：

初代培养基与继代培养基。

3.作用不同分为：

诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。

4.根据营养水平不同分为：基本培养基和完全培养基。基本培养基主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等；完全培养基就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质 。

（二）培养基的成分 主要包括：

1、无机营养（即无机盐类）：分为大量元素和微量元素

2、维生素类：B族维生素，如硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3 ，又称维生素PP）和泛酸钙（维生素B5）、叶酸（维生素Bc）、抗坏血酸（维生素C）等

3、氨基酸：有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等

4、有机附加物：包括有些成分尚不清楚的天然提取物，

5、糖类和琼脂：

6、植物生长调节物质：主要包括生长素和细胞分裂素。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚丙酸（IPA）、萘氧乙酸（NOA）。常用细胞分裂素有玉米素（ZT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）等。

7、活性碳

（三）培养基配制

1.水和药品的准备：

2.器皿和用具的准备：不同型号的烧杯、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、三角瓶、试管、培养瓶、培养基分装器等

3.母液的配制和保存：经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释 。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸等母液；生长调节物质也可分别配制成溶液，储存于冰箱

（1）配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NH4NO3165g、KH2PO417g、KNO3190g、CaCl2·2H2O44g、MgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI0.083g、Na2MoO4·2H2O0.025g、H3BO30.62g、MnSO4·H2O1.69g、CuSO4·5H2O0.0025g、CoCl2·6H2O0.0025g、ZnSO4·7H2O0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液，即先分别称取CuSO4·5H 2O0.05g、CoCl2·6H 2O0.05g、各自配成100mL的调整液，然后取5mL就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇10g、盐酸硫胺素（VB1）0.01g、烟酸0.05g、甘氨酸0.2g、盐酸吡哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液

一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73g、FeSO4·7H2O2.78g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（5）激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100mL母液。

4.培养基的配制及其灭菌：应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能和其它培养基一起高压消毒，而要进行过滤消毒

（四）常用培养基配方及特点

1.MS培养基 ：特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富

2.White培养基 ：特点是无机盐浓度较低

3.N6培养基 ：特点是KNO3和（NH4）2SO4含量高且不含钼。

4.B5培养基：特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。

四、 植物组织培养基本操作和培养技术

（一）玻璃器皿清洗

（二）培养基配制

（三）外植体的选择和灭菌

操作技术基本要点：一是要创造无菌的条件；二是要在无菌的适当条件下培育植物材料，这就必须注意材料的选择、培养基的组成、激素的应用、培养方法和培养条件等等。

1.选择优良种质、健壮的植株、选择最适时期、选取适宜大小

2.外植体的灭菌：外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取预处理是，先对植物组织进行修整，去掉不需要部分，在流水中冲洗干净。经过预处理植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。

常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

（五）无菌培养（接种后的外植体应送到培养室去培养）

1.培养条件 最主要的是光照、温度、湿度、氧气等。

光照 普通要求每日光照12h～16h，光强1000lx～5000lx ；

温度 大多数植物最适温度在23 C～32 C之间。一般所用的温度是25 C±2 C。低于15 C或高于35 C，对生长都是不利；

湿度 一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度。要求室内保持70%～80%的相对湿度。

※ 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及积累一些组织代谢产物，因此必须将组织转移到新培养基上。这种转移过程称为继代或称传代。一般在25 C～28 C下进行固体培养时，每隔4～6周进行一次继代培养。

（六）定期检查和观察

在培养中易出现下列现象：

1.出现污染现象

2.外植体的褐化现象

3.培养物的玻璃化现象

※菌类污染、褐化和玻璃化称为植物组织培养的3大难题

1.污染的原因: 从病源菌方面,主要有细菌及真菌两大类；

从污染的途径，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。

2、污染的预防措施:

※防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养 （2）避免阴雨天在田间采取外植体 3）目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法

※外植体的灭菌 ：（1）多次灭菌法（2）多种药液交替浸泡法

※器皿与金属器械的灭菌 ；

※布质制品的灭菌 ；

※无菌操作室的灭菌 ；

※操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行。

外植体的褐变及其预防措施

1、原因：褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。

2、影响褐变的因素

随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。

3、褐变的预防措施：

选择适宜的外植体 ；

采用适宜的培养基和光温条件；

在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂；

缩短转瓶周期 ；

培养物的玻璃化现象及其预防措施

1、什么叫玻璃化现象？

与正常苗有显著差异:其叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。

2、玻璃化的原因：激素浓度；琼脂浓度 ；温度 ；光照时间 ；通风条件；离子水平 ；

3、预防玻璃化的措施 ：

适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 ；增加自然光照，控制光照时间 ；控制温度 ；改善培养器皿气体交换状况；培养基中添加其它物质 ；

（七）试管苗的生根、驯化与移栽

1.试管苗特点

试管苗生态环境:高温、高湿、弱光和无菌；

试管苗与常规苗相比：第1，试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；第2，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用功能较差；第3，试管苗的叶片气孔数目少，活性差；第4，试管苗根的吸收功能弱 。

2.试管苗的驯化 ：目的在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，最终达到提高试管苗的移栽成活率 。

3.试管苗的移栽 ：

第二节 动物细胞培养

一、 动物细胞特点

● 无细胞壁

● 倍增时间长，生长缓慢

● 需氧量少，对搅拌敏感

● 聚集体形成

● 原代细胞培养50代即开始退化

二、生长特性

● 贴附生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞

● 悬浮生长型细胞：如血液白细胞，淋巴组织细胞等

三、体外培养特点

● 营养条件苛刻

● 适应性差, 敏感

● 培养时间长，易污染

四、体外培养条件

● 温度，37度

● pH：7.2-7.4

● 气体：氧，二氧化碳，氮气

● 营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供

五、 体外细胞生长增殖过程

原代培养期；

传代培养期；

衰退期

六、设备、试剂及培养基的选择和配制

1.设备包括培养箱(特别是二氧化碳培养箱)、无菌室或者超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜、各种规格的培养瓶(包括无钾玻璃的或无毒塑料的、封闭式的或螺口式的等)

2.常用试剂有抗生素 、贴壁因子、生长因子，还需要激素、凝集素、脂多糖(LPS)、各种营养剂胰酶、胶原酶、EDTA、各种生物缓冲剂等

3. 培养基的选择和配制

培养基由三部分组成：基础培养基、血清和基质。

自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培养基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、199、RPMI1640、EBSS、HBSS、McCoy‘s5a、Fischer’s、

BGjb、Swim‘sS 77等；培养基中血清的浓度范围为5％～20％，以10％浓度最为常用；为维持某些细胞在体外的生机或增殖力，还需要事先在培养基中添加纤黏素、昆布氨酸、白明胶之类的贴壁因子。 一般用无水粉剂配制培养基 ，过滤和收集 ；

七、培养方法

悬滴； 旋转管；灌注小室；培养瓶； 培养板

八、组织培养的污染、检测和排除

1.污染的主要途径和媒介的发生

空气、清洗消毒、操作、血清、组织

2.组织细胞污染的检测

真菌污染

细菌污染

支原体污染

3.组织细胞污染的排除

抗生素除菌法、加温除菌法、动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法

九、细胞培养物在液氮中的保存和复苏

(一)培养物在液氮中的保存

(二)冻存细胞的复苏

(三)细胞培养物冻存和复苏中的安全措施

十、动物组织培养的一些新应用

(一)组织工程

组织工程用于重建组织和器官，强化组织和器官的功能。

(二)毒理学研究

细胞培养技术可用来作为毒理学试验的重要手段。

(三)骨溶解病变过程的观察

(四)细胞衰老的研究

(五)神经细胞保护的研究

十一 克隆技术及其应用

根据克隆的层次分为基因克隆、细胞克隆、组织克隆、器官克隆及完整的生物体克隆。

(1)基因克隆是指通过分子重组技术或是扩增（如PCR扩增）DNA片断的相同序列的大量拷贝，它是深入研究基因的结构、转化、表达、调控及进行基因改造的基础。常用的目的基因克隆技术包括：①通过已知基因产物的分析和鉴定，进一步确定氨基酸顺序后推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR引物来分离目的基因。②通过遗传表型分析的基因克隆，首先通过物理、化学或是生物的方法引起某一基因失活或过量表达，产生一些突变体，然后找出突变体文库和野生型文库中的差异，分离目的基因。③以图谱为基础的定位克隆技术，该技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本

前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。随着基因组测序及生物信息学的快速发展，还有根据同源序列进行克隆，使电子PCR进行克隆及使用DNA芯片技术进行新基因筛选和克隆等许多新的方法，使基因克隆的效率不断提高。

(2)细胞克隆、组织克隆和器官克隆是克隆技术在细胞水平、组织水平和器官水平上的应用，可用来生产大量相同的细胞、组织和器官。细胞克隆技术在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用较多。

(2)动物克隆。

①科学家选取了三只母羊，通过显微操作先将一只母羊的卵细胞核质分离，使卵失去原有的遗传物质，仅余细胞质；②然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞的核与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞；③使核质融合的卵在体外培养发育为早期胚胎；④当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊“多莉”。“多莉”提供乳腺细胞的6岁母羊。此次克隆的成功，从理论上说明了高度分化细胞，经过一定手段处理之后，也可回复到受精卵时期的合子功能。动物克隆技术的成熟对生物遗传疾病的治疗、优良品种的培育和扩群等提供了重要途径，并对物种的优化、濒危动物的种质保存和转基因

动物的扩群均有一定作用。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/63f9de1d710abb68a98271fe910ef12d2bf9a98c.html