水稻转化方法

水稻转化方法

水稻转化 (来自文献http://www.springerlink.com/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf)

For rice transformation, mature rice seeds were de-husked and sterilised with 3% sodium hypochlorite (30 min). The seeds were thoroughly washed three times with sterile distilled water and transferred onto MS basal medium (Murashige and Skoog1962) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolyte, 2 mg/l 2,4-dichlorphenoxy acidic acid (2,4-D) and 30 g sucrose, for 1 week. The freshly induced calli were dipped in Agrobacterium tumefaciens (AGL1 strain) and transferred onto NB medium (N6 macro-elements, B5 micro-elements) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolysate, and 30 g sucrose. After co-cultivation with Agrobacterium (no dim light, 28℃, 2 days), the calli were transferred onto NB medium containing 2 mg/l 2,4-D, 120 mg/l G418, and 500 mg/l Cefotaxime. The resistant calli were subcultured on fresh plates at 2-week intervals for 4 weeks, and then transferred onto MS medium containing 0.2 mg/l anaphthalene acetic acid (NAA), 3 mg/l 6-benzylaminopurine (6-BA) and 150 mg/l G418 until shoots regenerated. Shoots were transferred onto 1/2 MS medium containing 0.5 mg/l NAA for rooting and further growth. The transgenic plants were grown inthe field or at 28℃ under a 16/8 h light/dark cycle in the greenhouse.

配置1升诱导培养基：

1. 水解酪蛋白 300 mg/L

2. 谷氨酰胺 500 mg/L

3. 脯氨酸 500 mg/L

4. 肌醇 100 mg/L

5. 蔗糖 30g/L

6. PHytagel 2.6 mg/L

N6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH 5.8

5.1水稻转化受体的准备

5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养

取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。

5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。

成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点 （病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）

注 意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。

5.2农杆菌的培养

将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

5.3水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好的继代到一定时间的水稻愈伤组织放入无菌三角瓶中,然后加入适量农杆菌悬浮液(至少保证有足够的菌液与材料接触),室温放置20min,并不时晃动。取出愈伤组织,在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上（将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置，愈伤应摆放整齐，相互之间最好不要叠放），26℃黑暗培养2-3天。

仔细挑选无菌、状态较好（继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，25℃黑暗培养2-3天。

5.4抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织（也可以水洗除菌后）放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

现象：愈伤组织在选择培养基上出现脓状现象，导致培养失败。减少菌量和共培养后水洗并不能消除这一现象。

对策：需要从两方面把关：从继代培养开始，精心挑选愈伤组织，杜绝染菌的愈伤组织。另一方面，严把农杆菌关：农杆菌不应该多次传代，坚持用单菌落的农杆菌划线。

5.5抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/l hygromycin B的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现，30-40天后进一步分化出小苗。

只要愈伤组织的质量符合要求，预分化并非必需。我们省略了预分化，将抗性愈伤组织直接转到分化培养基上，不但节省了能源、昂贵的hygromycin B和ABA，大大降低了成本，而且使转基因的时间缩短了10天。

5.6生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。

A， 再生的转基因苗要适时移到生根培养基上，保证转基因苗在试管中生长正常。

B， 对过于细小的苗通过剪根、剪叶和再次转培，使转基因苗强壮。

C， 选苗高约10-15cm，根系旺盛的试管苗，选择时机直接移栽入土。

D， 平整土地，保持水位，适当遮阴。

1，试管苗根系发达，株高约10cm

2，选择天气：春夏季选阴天、傍晚移栽；

冬季选晴天移栽，连续阴雨天不适合移栽

3，洗根时的水温要与土温基本一致

4，洗根和移栽时不要将成丛的试管苗分开

5，平整土地，控制水面，水不能淹没植株

培养基

（1） LB培养基

（2） YM培养基

（3）NB基本培养基

KNO3 2830 mg/L

(NH4)2SO4 463 mg/L

KH2PO4 400 mg/L

MgSO4.7H2O 185 mg/L

CaCl2.2H2O 166 mg/L

FeSO4.7H2O 27.8mg/L

Na2EDTA 37. 5 mg/L

MnSO4.4H2O 10 mg/L

H3BO3 3 mg/L

ZnSO4.7H2O 2 mg/L

Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L

CuSO4.5H2O 0.025 mg/L

CoCl2.6H2O 0.025 mg/L

KI 0.75 mg/L

盐酸硫胺素 10 mg/L

盐酸吡哆醇 1 mg/L

烟酸 1 mg/L

肌醇 100 mg/L

水解酪蛋白 300 mg/L

谷氨酰胺 500 mg/L

脯氨酸 500 mg/L

蔗糖 30,000 mg/L

PHytagel 2.6 mg/L

pH 5.8

(4)水稻愈伤诱导及继代培养基（粳稻）

（5）共培养培养基

NB基本培养基(不包括谷氨酰胺和脯氨酸，加10克葡萄糖/升)

2,4-D 2 mg/L

肌醇 2 mg/L

pH 5.5-5.2

AS(acetosyringone,乙酰丁香酮) 100µM 10-20毫克/升

注释：AS于用前溶化的培养基放至55℃左右时加入；

共培养液体培养基中不加2,4-D。

（6）抗性筛选培养基

NB基本培养基

2,4-D 2 mg/L

cefotaxine(头孢霉素) 500 mg/L

hygromycin B(潮霉素) 50 mg/L

pH 5.8

二筛时可适当降低头孢浓度。

（7）水稻分化培养基（粳稻）

(8)水稻长根壮苗培养基（粳稻）

(9) 20×N6大量元素母液

（10） 100×B5 有机母液

（11）100×B5微量元素母液

12）100×MS Fe盐溶液

(13)20×MS大量元素母液

(14)100×MS微量元素母液

(15) 100×MS有机元素母液

培养基和激素母液配制方法

（1）100×MS Fe盐溶液

称取2.78gFeSO4•7H2O溶于水（A液）；

称取3.75 gNa2•EDTA溶于热水（B液）；

混合A液B液，加水接近1000ml；

把混合液置于微波炉内加热煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温；

定容到1升后置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（2）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法

称取100mg 2,4-D，置于小烧杯内；

加少量无水乙醇使之完全溶解；

把2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配置；

定容至200ml，4℃保存。

（3）0.5mg/ml α-NAA母液的配法

称取100mgNAA置于小烧杯内；

用1N的KOH溶液溶解NAA；

用水定容至200ml，4℃保存。

（4）0.5mg/ml 6-BA母液的配法

称取100mg 6-BA置于小烧杯中；

加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；

用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（5）100mM乙酰丁香酮（As）的配制

称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，并定容至10ml，分装入无菌的小管，

-20℃冰冻保存。

（6） 5mg/ml KT的配法

称取100mg kenetin，用少量1N KOH溶解，用水稀释定容至20ml。过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃冰冻保存

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/5e45cbfc04a1b0717fd5dda9.html