基因探针技术及其在食品微生物检测中的应用

发布时间：2013-05-27 10:48:34 来源：文档文库

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摘　要　建立在DNA 杂交基础上的基因探针技术是现代分子生物学中的一种常规技术。

用基因探针技术检测食品中的有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。

近年来,有关非放射性基因探针、DNA 生物传感器探针及分子信标探针等技术研究取得的重

要进展,必将加速基因探针技术在食品微生物检测中的应用。本文对多种基因探针的技术原

理与研究应用概况及最新进展进行了综述讨论。

关键字　　基因探针　食品病原菌　检测

食品卫生检验中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的病原性微生物。这些病原性微生物的存在会给消费者的健康带来极大的危害。传统的微生物检测方法一般都涉及到对病原性微生物的培养、形态及生理生化特性的分析等程序[1 ] ,经长期的实践证明,这些传统方法是比较有效的,而且检测病原性微生物的特异性也比较高。但传统的微生物检测方法亦存在不少问题,例如检测成本高、速度慢、效率低,而且有些病原体生长速度很慢,很难用传统方法检测。由于传统的微生物检测方法需要对病原菌进行人工培养,因而比较适宜于对那些已知的微生物进行检测,而对一些新的病原菌用传统方法进行检测就具有一定的盲目性。另外还有些病原体, 如某些类菌原体( mi2croplasm) ,甚至无法通过人工培养方法获得。基因探针技术作为现代分子生物学中的一种技术手段,应用于食品微生物检测不但能克服传统食品微生物检验方法的不足,而且还具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点.

1 　基因探针技术原理

基因探针或DNA 探针技术检测微生物的依据是核酸杂交,其工作原理是2 条碱基互补DNA链在适当条件下可以按碱基配对原则,形成杂交DNA 分子。已知每个生物体的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定的,例如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有表达了某个或某些有害的基因而产生的。从理论上讲,任何一个决定生物体特定生物学特性的DNA 序列都应该是独特的。如果将某一种微生物的特征基因DNA 双链中的一条进行标记,链式反应(polymerase chainreactio例如用32P 同位素标记,即可制成DNA 探针。由于DNA 分子杂交时严格遵守碱基配对的原则,通过考查待测样品与标记性DNA 探针能否形成杂交分子,即可判断样品中是否含有此种微生物,并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。

2 PCR与DNA 探针检测技术

通过聚合酶n , PCR) 技术可以特异性扩增出致病菌的某一特定的DNA 序列,因此PCR 技术常与DNA 探针技术联合使用,用于检测样品中微量的病原微生物,这大大提高了DNA探针检测技术的灵敏度。由于利用PCR进行DNA 序列扩增时,对模板的要求量很少,因此即使样品中致病菌的数量很小,亦无需进行病菌的分离培养。PCR 与DNA 探针结合使用检测样品中致病微生物的一般程序是,首先对待检样品中的目标DNA 进行PCR 特异性扩增,然后用上述的各种DNA 探针检测PCR 扩增产物。利用PCR 技术虽然可以显著提高DNA探针的检测灵敏度,但由于PCR 的极度灵敏性,常出现因操作污染而产生假阳性,目前已有一些方法可以防止假阳性的产生,比较简单的方法是将模板的扩增与探针检测放在同一个封闭的试管中进行。

3 　DNA 探针技术在食品微生物检测中的应用

　近年来DNA 探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃,目前已可以用DNA 探针检测食品中的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶希氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等。用DNA 探针杂交技术检测食品中微生物的关键是DNA 探针的构建。为了保证检测方法的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构造各种不同的DNA 探针。构建检测食品微生物DNA 探针的原则是以待检微生物中的特异性保守基因序列为目标DNA ,以该序列的互补DNA 作为杂交探针。对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特性的基因序列构建特异性的DNA 探针。例如与其它微生物相比,大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特性,Cleuziat 等用大肠杆菌中编码该酶的基因序列作为目标DNA ,并制成DNA 探针, 用以检测食品中的总大肠杆菌。而对不同种类的大肠杆菌,如产肠毒素的大肠杆菌( ETEC) 、致肠出血大肠杆菌(EHEC) 以及致肠病的大肠杆菌( EPEC) 等的检测鉴别,已分别使用产肠毒素基因序列、致肠出血的基因序列及致肠病的基因序列作为目标DNA ,构造出相应的DNA 探针,用以鉴别上述不同种类的大肠杆菌。

4 　展　望

虽然目前传统的分离培养方法仍然是检测食品微生物时常用的方法,但存在检测成本高,费时等缺点,对大部分微生物来说,用传统方法检测至少需要4～5 d 时间。有些致病微生物甚至无法进行人工培养。利用微生物生理生化特性鉴别微生物的传统方法在实际应用时也遇到越来越多的问题。可见研究更加快速、准确的微生物检测方法具有十分重要的意义。DNA 探针杂交与PCR 联合使用检测食品微生物具有特异性强、灵敏度高及操作简便快速等特点,将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向。目前利用DNA 探针技术检测食品中的微生物已取得了不少重要成果。美国的Gene2Trak 公司已开发出检测大肠杆菌的商品化DNA 探针系统。以PCR 扩增大肠杆菌的目标DNA ,在用DNA 探针杂交检测,不需要进行微生物分离培养,最快可以在1 h 内完成检测操作,检测灵敏度为103个大肠杆菌细胞每g 或每mL 食品样品。如与免疫等其它技术联用,还可以使检测灵敏度大大提高。近年来随着DNA 生物传感器探针等新技术的研究不断取得进展,可望在不远的将来开发出一种DNA 探针检测仪,用于食品微生物的快速检测,最终实现对食品产品的现场及在线检测。虽然我国目前利用DNA 探针技术检测食品中微生物的研究报道尚不多见,但是随着现代分子生物学技术的快速发展,特别是基因测序技术的发展,各种新的DNA 探针检测技术的出现,将会使该项技术在食品微生物检测中得到更加广泛的应用,也将吸收国内更多的研究者加入到这一领域中来。