内参基因
发布时间：2011-11-29 来源：文档文库
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何为内参基因1、我记得常用的就是[color=magenta]GAPDH[/color]（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和actin，至于什么是内参，可以打个比方，比如我们要比较两个不一样大的西瓜的含糖量，不好直接比较，那就找他们都有的东西来比较，就拿西瓜子嘛，假设西瓜子是均匀分布的，而且随着西瓜的变大，糖分的增多，西瓜子也变多，那么这个西瓜子就可以作为内参了！ 不知比方准确否，请高手指教，共同进步！
2、内参基因一般会选管家基因，是维持细胞基本代谢活动所必须的基因，在各组织和细胞中的表达相对恒定，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
3、内参基因,表达稳定，通常用的有GAPDH,beta-actin，18s rRNA等 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。
4、半定量RT-PCR和qPCR都需要内参，简单的说内参就是在你的那个培养条件下恒定表达的某个基因。做内参就是以内参引物PCR扩增该内参基因，看在你选定的几个时间点是不是都恒定表达，如果恒定才能说明你做PCR选的RNA（一部发RT-PCR）或cDNA(两步法RT-PCR的量是等量的，这样比较你的目的基因的丰度才有意义。
内参是相对的，不是绝对的，因为内参基因有时会受到影响。
量PCR问题--绝对定量与相对定量有什么区别？
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。
绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。
相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是
绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。
定量PCR问题--标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？
假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：
定量PCR问题--什么是CT值比较法？数据怎么处理？
CT值与起始DNA浓度的对数成反比：
如果(1不同管之间的PCR反应效率相同；(2这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02 = 2 -ΔΔCT
假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。数据的处理方法见下表：
定量PCR问题--定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？
总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。
首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。
其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S 