酶工程复习材料 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析

酶工程复习材料

1. 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？

离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。

操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度 c梯度洗脱法:改变溶液的pH

d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。

凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样:体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。d洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。

亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。

2. 酶的分类：

根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类

（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）

全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子

根据酶蛋白结构特点可将酶分为

单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。

3. 酶合成调节的类型

诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏

4. 酶合成的调节机制：1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 2.末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

3.分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

5. 酶发酵动力学：主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。

产酶动力学：主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。分为宏观酶动力学和微观酶动力学

1. 细胞破碎确认： 1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。

3.测定释放的蛋白质量或酶活力：

测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

2. 固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。

3. 固定化酶的性质: 1. 稳定性2. 最适温度3、最适pH 4、底物特异性

(一) 稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。

（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶

(2) 对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。

（3) 对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。

(4) 保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。

(二) 最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低

(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同

(三) 最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适pH影响(2) 产物性质对最适pH影响

载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。

影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固相酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固相酶，其最适pH比游离酶高。反之，亦然。（见示意图）

产物性质对最适pH影响:若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。

4.联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。

菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。

以枯草芽胞杆菌的分离为例：

②带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。

②配制分离选择培养基，灭菌备用。

③稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混 合均匀后再取1ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml 到第三支试管中，以此类推。

④配制斜面培养基，灭菌备用。

⑤涂布培养：取 10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8 个平板，倒置后在 37℃培养24-48 小时， 观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在 37℃培养。

1. 酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。

酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA相对稳定。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。其对应的mRNA稳定性高。其中最理想的合成模式是延续合成型。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成 一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。

2. 酶的固定化方法主要有哪些？作简单阐述

将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价键结合法，以及交联法等

1.包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。操作简单，可制得较高活力的固定化酶。

2.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等.操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不太牢固易脱落

3.共价键结合法：酶蛋白侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。

4.交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制得固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。制备的固定化酶结合牢固，可长时使用.但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大

3. 什么是酶的体外定向进化，什么是 DNA改组（DNA shuffling）

所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

DNA 改组（DNA shuffling）又称有性 PCR DNA或DNA重排，是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子的方法。

4. 酶的非水相催化有何优点，它们的主要类型有哪些？

优点：①提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化

②水解酶能催化合成反应，如脂的合成和肽的合成.

③可以控制由水引起的副反应

④酶不溶于有机介质，易于回收再利用

⑤酶的固定化简单，可以只沉积在载体表面

⑥从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易

⑦酶的热稳定比水高，而且没有微生物污染

类型：

⑴有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

⑵气相介质中的酶催化： 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

⑶超临界介质中的酶催化： 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。

⑷离子液介质中的酶催化： 酶在离子液中进行的催化作用。 离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。

5. 水在酶的非水相催化中有什么作用？

水的作用：⑴必需水与低水系统。严格的说，酶在绝对无水的条件下，是不可能具有催化活力的。酶的催化功能与它的空间结构紧密相关，破坏其空间构象，酶便失去其催化功能。维持酶蛋白空间构象的主要作用力是氢键，疏水作用和范德华力。在水溶液中，水分子直接或间接地通过这些化学键来维持酶分子催化活力所必需的构象，而且水在酶的稳定性及动力学性态的决定上起着重要的作用。含水量与酶的稳定性有关。酶在脱水条件下异常稳定。

⑵必需水对酶活性影响，不是所有水溶液中的水分子都与酶催化活性有关。实际上只有必需水才重要。在水合过程中酶蛋白结构没有明显的变化。必须水量也决定于有机溶剂。

酶与酶工程练习题一

一 名词解释（每题3分，共计30分）

1、 酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。

2、自杀性底物：底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露，再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂，这种底物叫自杀性底物。

3、别构酶：调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶

4、诱导酶：有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶

5、Mol催化活性：表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目

6、离子交换层析：利用离子交换剂作为载体这些载体在一定条件下带有一定的电荷，当带相反电荷的分子通过时，由于静电引力就会被载体吸附，这种分离方法叫离子交换层析。

7、固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶

8、修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶

9、非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学

10、模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。

二 填空题(每空1分,共计30分)

1、决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是反应条件

2、求Km最常用的方法是双倒数作图法

3、多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是序列机制，另一类是乒乓机制。

4、可逆抑制作用可分为 竞争性 反竞争性 非竞争性 混合性

5、对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌 ，二是能够利用廉价原料，发酵周期 短，产酶量 高 ，三是菌种不易 退化 ，四是最好选用能产生 胞外 酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。

6、酶活力的测定方法可用 终止反应法和 连续反应法。

7、酶制剂有四种类型即 液体酶制剂、 固体酶制剂 、纯酶制剂和 固定化酶制剂

8、通常酶的固定化方法有 吸附法、共价键结合法、交联法和包埋法

9、酶分子的体外改造包括酶的表面修饰和 内部修饰。

10、模拟酶的两种类型是半合成酶和全合成酶 。

11、抗体酶的制备方法有 拷贝法和 引入法

三 问答题(每题10分,共计40分)

1、固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？

答：优点：（1）易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺

（2）可以在较长的时间内连续使用 （3）反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化

（4）提高了酶的稳定性 （5）较能适于多酶反应 （6）酶的使用效率高 产率高 成本低

缺点：（1）固定化时酶的活力有损失 （2）比较适应于水溶性底物

（3）与完整的细胞相比，不适于多酶反应。

2、写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。

答：方法：1）透析 2)盐析 热、酸碱变性

3、为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？

答：（1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样

（2）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶

（3）来源广泛，价格便宜

（4）微生物易得，生长周期短

（5）可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高

（6）可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种

酶工程练习题题二

1、名词解释：

1、抗体酶：是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶

2、酶反应器：是利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，他为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物。

3、模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。

4、底物抑制：在酶促反应中，高底物浓度使反应速度降低的现象。

产物抑制：

5、稳定pH：酶在一定的pH范围之内是稳定的，超过这个限度易变性失活，这样的pH范围为此酶的稳定pH

6、产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。

7、凝胶过滤：又叫分子排阻层析，分子筛层析，在层析柱中填充分子筛，加入待纯化样品再用适当缓冲液淋洗，样品中的分子经过一定距离的层析柱后，按分子大小先后顺序流出的，彼此分开的层析方法。

8、固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶

9、非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学

10、液体发酵法：以液体培养基为原料进行微生物的繁殖和产酶的方法，根据通风方法不同又分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。

二、填空题。

1、Km值增加，其抑制剂属于竞争性抑制剂，Km不变，其抑制剂属于非竞争性抑制剂，Km减小，其抑制剂属于反竞争性抑制剂。

2、菌种培养一般采用的方法有固体培养法和液体培养法。

3、菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括温度 ，pH，通风量（或氧气），搅拌，泡沫 和 湿度等。

4、打破酶合成调节机制限制的方有控制条件，遗传控制，其他方法。

5、酶生物合成的模式是 同步合成型、延续合成型 、中期合成型 、滞后合成型

6、根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有热变性法、酸碱变性法、表面变性法

7.、通常酶的固定化方法有吸附法、共价键结合法、交联法、包埋法

8、酶分子的体外改造包括酶的表面修饰和内部修饰。

9、酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的过滤态，从而降低了底物分子的能障，而抗体结合的抗原只是一个基态分子，所以没有催化能力

三 问答题(每题10分,共计40分)

1、在生产实践中，对产酶菌有何要求？

答：一般必须符合下列条件：

1）不应当是致病菌，在系统发育上最好是与病原菌无关

2）能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高

3)菌种不易变异退化，不易感染噬菌体

4)最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高

5)在食品和医药工业上应用，安全问题更显得重要。

4、某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化倍数。

答：1）起始总活力：200120＝24000（单位） 2）起始比活力：2002.5＝80（单位/毫克蛋白氮）3）纯化后总活力8105＝4050（单位）4）纯化后比活力8101.5＝540（单位/毫克蛋白氮）5）产率（百分产量）：405024000＝17％ 6）纯化倍数：54080=6.75

练习题三

一、是非题

1、 酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。 （ ╳）

2、 酶的分类与命名的基础是酶的专一性。 （√ ）

3、 酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。 （√）

4、 液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 （√）

5、 培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。 （╳）

6、 膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。 （√）

7、 在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。 （√）

8、 角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。 （╳）

9、 α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。 （╳）

10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。 （╳）

二、填空题

1、 日本称为“酵素”的东西，中文称为酶,英文则为Enzyme,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其实它存在于生物体的细胞内与细胞外。

2、 1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得脲酶结晶，并指出酶的本质是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。

3、 目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为As3.4309,高产液化酶优良菌株菌号为BF7.658。在微生物分类上，前者属于霉菌，后者属于细菌。

4、 1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、启动基因和结构基因。

5、 1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）每1分钟内,催化1μmol的底物转化为产物的酶量为一个国际单位，即1IU。

6、 酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的活力、减少抗原性，增加稳定性。

7、 酶的生产方法有提取法，发酵法和化学合成法。

8、 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。

9、 酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。

10、由于各种分子形成结晶条件的不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是纯化手段，也是纯化标志。

一、 名词术语的解释与区别（每组6分，共30分）

1、酶生物合成中的转录与翻译

答：酶合成中的转录是指以核苷三磷酸为底物，以DNA链为模板，在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。酶合成中的翻译是指以氨基酸为底物，以mRNA为模板，在酶和辅助因子的共同作用下合成蛋白质的多肽链。

2、诱导与阻遏

答：酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程；酶合成的阻遏作用则是指加入某种物质使酶的合成中止或减缓进行的过程。这些物质分别称为诱导物及阻遏物。

3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比）

答：酶的回收率是指某纯化步骤后酶的总活力与该步骤前的总活力之比。酶的纯化比是之某纯化步骤后的酶的比活力与该步骤前的比活力之比。

4、酶的变性与酶的失活

答：酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏，酶的空间结构也受到破坏，原来有序、完整的结构变成了无序，松散的结构，失去了原有的生理功能。酶的失活则是指酶的自身活性受损（包括辅酶、金属离子受损），失去了与底物结合的能力。

5、α－淀粉酶与β－淀粉酶

答：二者的区别在于α－淀粉酶是一种内酶，可以跨越淀粉分子的α－1，6键到分子内部进行随机切割，所得的产物为α型的麦芽糖和环糊精，它使碘色消失的速度较快，但还原糖较慢；β－淀粉酶则是一种外酶，不能跨越α－1，6键，只能从淀粉的非还原末端2个2个地进行切割，所得的产物为β型的麦芽糖和界限糊精，它使碘色消失较慢，但还原糖较快，二者的共同点在于都能水解α－1，4键和都不能水解α－1，6键。

二、 问答题

3、如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂？试用所学过的知识加以论述。

要检测酶的制剂是否达到纯的制剂（即不含杂质及杂质酶），可以有以下几种方法：

1）层析法：包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析

2）电泳法：包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法

3）超离心法：不同的酶分子大小不同，在重力场中具有不同的沉降系数，从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。

4）免疫反应法：由于酶分子可作为一种抗原物质，而抗原与抗体之间具有专一的亲和力，故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳，从而判断酶的制剂是否纯净。

5）氨基酸序列分析法：采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来，最终可获知该酶的氨基酸序列，从而也可以判断出酶制剂是否纯净。

酶工程期末考试试题(A)

任课教师：贾英民

一 名词解释：( 每小题3分 共30分)

1 酶催化的专一性： 绝对专一性和相对专一性；

2 酶催化的邻近效应、定向效应：底物彼此靠近、活性中心浓度增大、底物与结合部位按有利于催化反应的方向定位；

3 Kcat：催化常数，即在最适条件下，没摩尔酶每分钟所转化的底物摩尔数；

4 酶活力：酶催化活力，用酶催化反应速度表示；

5 酶催化周期：每mole酶蛋白催化每mole底物所需要的时间；

6 Ks盐析和β盐析

Ks盐析：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铵。

β盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。

7 离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。

8 生物酶工程：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等。

本章主要介绍 核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶的有关基本概念和基本知识。

9 酶分子的定向进化：

是指在分子水平上，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质的酶蛋白。

10 核酶：化学本质是核酸的酶，包括核酶和脱氧核酶

二 填空题：（每空1分 共 20分）

⑴ 按催化反应类型分，将酶分成6个大类，它们的名称及其代码分别是 氧化还原酶 、

转移酶 、 水解酶 、裂合酶 、 异构酶 、 连接酶 ；

⑵ 根据葡聚糖凝胶的交联度不同，软胶包括 G75 、 G100 、 G150 、 G200 ；

⑶ 酶固定化方法有 吸附法、 交联法 、吸附交联法 、共价结合法 、微胶囊法 ；

⑷ 酶蛋白化学修饰的方法包括 金属离子置换 、 大分子结合 、 肽链有限水解 、

氨基酸置换 、 侧链基团修饰 ；

三 简答题（每题6分 共30分）

2 简述离子交换层析分离酶蛋白的基本操作程序

离子交换剂预处理、最适洗脱液pH确定、装柱、平衡、上样、洗脱、分部收集、收集与浓缩；

3 简述提高固定化酶的稳定性的途径

⑴ 用化学修饰增加与载体相反的电荷

⑵ 固定化酶与底物形成复合物

⑶ 添加隋性蛋白质

⑷ 增强载体凝胶多孔性和结构有序性

⑸ 同时固定化能消除产物抑制的酶

4 简述核酶的主要类型

剪切型核酶：这类核酶主要催化自身或异体RNA的切割，相当于核酸内切酶的作用。

目前发现的剪切型核酶包括三种：① 锤头型核酶 ② 发卡型核酶③ 蛋白质－RNA 复合酶

剪接型核酶：这类核酶主要催化mRNA前体的修饰加工，切除内含子，并完成片段的拼接； 主要包括组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子。

5 简述酶分子定向进化的主要方法

易错PCR方法；DNA改组方法；基因家族之间的同源重组方法；

酶工程期末考试试题(B)

任课教师：贾英民

一 名词解释：( 每小题3分 共30分)

1 酶活性中心：酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。

2 酶催化的邻近效应、定向效应：：底物彼此靠近、活性中心浓度增大、底物与结合部位按有利于催化反应的方向定位；

3 Km：米氏常数，指最大反应速度一半时的底物浓度

4 酶比活力：单位质量的酶催化活力

5 酶催化常数：即在最适条件下，没摩尔酶每分钟所转化的底物摩尔数；

6 盐析：即利用中性盐与蛋白质争夺水相原理沉淀蛋白质的方法，包括Ks盐析和β盐析

7 超滤：即超过滤，本技术过滤截留的颗粒直径在20—2000A（0.2μm)相当于分子量1000—5×105Da,并且有多种规格供选用。

8 离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。

9 固定化酶活收率：固定化酶制剂的催化活力与固定化处理所用游离酶活力之比

10 酶分子的定向进化： 酶分子的定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质的酶蛋白。

二 填空题：（每空1分 共 20分）

⑴ 酶蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后常用的染色剂有 氨基黑 、 考马斯亮兰G250 、 考马斯亮兰250 ；

⑵ 核酶的类型包括 剪切型核酶 、剪接型核酶、其中前者包括：

锤头型核酶 、 发卡型核酶 、 蛋白质－RNA 复合酶 ， 后者主要是 组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子 ；

⑶ 酶蛋白化学修饰的方法包 金属离子置换 、 大分子结合 、 肽链有限水解 、 氨基酸置换 、 侧链基团修饰 ；

⑷ 酶蛋白基因定向进化的方法有：易错PCR方法；DNA改组方法；基因家族之间的同源重组方法；

⑸ 酶制剂生产的固态发酵方法有： 浅盘发酵法、 转桶发酵法、 厚层通气发酵法；

三 简答题（每题6分 共30分）

1 简述酶活力测定的基本原则

① 提供最适底物：由于酶的底物专一性，测定酶活力时，提供的底物必须是最适底物，当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。

② 测定时酶量适当。

③ 确定反应时间适宜。

④ 反应条件应是最适反应条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离子环境。

2 简述细胞破碎的方法

① 机械破碎法；② 物理破碎法；③ 化学方法。

5 简述酶分子定向进化的主要方法

①易错PCR方法；②DNA改组方法；③基因家族之间的同源重组方法；

四 论述题（每题10分 共20分）

1 结合酶制剂的应用论述酶分子定向进化的酶工程意义

⑴ 提高酶分子的催化活力；

⑵ 改善酶蛋白的稳定性；

⑶ 改善酶蛋白的底物专一性；

⑷ 通过酶蛋白分子对应用环境的适应能力。

2 与游离酶比较论述固定化酶在应用上的优越性

① 增加酶稳定性。

② 改善酶制剂的应用工艺。

③ 使酶蛋白得到重复使用。

④ 便于使酶蛋白与催化产物分离。

北京化工大学

一、判断题（每题1分，共10分）

1. 酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。 （× ）

2. 酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（ ）

3. 液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 （ ）

4. 培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。 （× ）

5. 在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。 （ ）

6. 补料是指在发酵过程中补充添加一定量的营养物质，补料的时间一般以发酵前期为好。（×）

7. 酶固定化过程中，固定化的载体应是疏水的。（×）

8. 在酶的抽提过程，抽提液的pH应接近酶蛋白的等电点。（× ）

9. 青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（ ）

10.亲和试剂又称活性部位指示试剂,这类修饰剂的结构类似于底物结构。（ ）

二、填空题（每空1分，共10分）

1. 日本称为“酵素”的东西，中文称为____酶_，英文则为__enzyme_，是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。

2. 1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__脲 酶_酶结晶，并指出_脲酶_是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1946年度诺贝尔化学奖。

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