电泳法

电 泳 法

朱莹 分析化学 S1*******

摘要：电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象，电泳不仅作为一种现象，而且作为一种技术方法得到不断发展。从界面分离到各种区带电泳，开辟了混合物的电泳分析的可能性。电泳不仅适用于蛋白质[1、2]、核酸[3]、糖[4]等生物大分子的分离分析，而且也能用于氨基酸[5]、手性药物[6]、维生素[7]、有机酸[8]的分离分析。毛细管电泳在分离机理和液相色谱之间有互补性，已越来越多地替代HPLC法用于有关物质的检测。本文详细介绍了电泳法的基本概念、分类及应用。

关键词：电泳、毛细管电泳、实际应用。

一、电泳法的基本原理

电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）[9]。

物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。

在两个平行电极上加一定的电压(V)，就会在电极中间产生电场强度(E)。

在稀溶液中，电场对带电分子的作用力(F)，等于所带净电荷与电场强度的乘积：

F=q·E

这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：

F’=6πrηυ

式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，

∴   q·E = 6πrηυ

电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电分子的迁移速度：   

所以，

m=υ/E=q/6πrη

这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。

由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，如：待分离生物大分子的性质、缓冲液的性质、电场强度、电渗、持介质的筛孔。

二、电泳法的分类

原则上按电泳的原理来分，现在有三种形式的电泳分离系统：即移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳或称置换（排代）电泳。

界面移动电泳可以确定带电物质的迁移率，并且能用来研究混合物的组成成分，但是它不能用来分离混合物，也不适用于研究低分子量的物质，主要用于蛋白质系统等生物大分子的研究方面。虽然它曾取得过很大的发展，但是由于设备复杂，操作时间很长，不能完全地分离混合物的各个组成等一些不可克服的缺点，已逐渐为区域电泳所代替，并从而发展为许多新的电泳法。

区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。但是支持介质有时会吸附不同分子或起分子筛作用（层析效应）而对分离起破坏或帮助作用。近50年来，固体支持介质可分为两类：一类如纸、醋酸纤维素薄膜等。它们是化学惰性的，能将对流减到最小。用这些介质分离主要是基于蛋白质的电荷密度。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。它们不仅能防止对流，把扩散减到最小，并且它们是多孔介质，孔径大小和生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效用[10]。

现国内外活化凝胶大多采用溴化氰法，但该法活化产生异脲键，易引起非特异行的吸附，在碱性环境中不稳定，且溴化氰毒性大，活化条件不易控制，活化时间超长可产生的有活性的氰酸酯迅速水解，导致偶联率下降而环氧氯丙烷法虽然鲜有人报道，但其毒性小，易操作，成烷胺键稳定性好，其带有的 -CL基团和环氧基团在活化时能使凝胶轻度交联,增加琼脂糖的强度 [11]

80年代末发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳方法，又称毛细管区带电泳。它是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离，分离的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。

稳态电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到一个稳态。在稳态达到后，带的宽度不随时间而变化，等电聚焦和等速点用应该是属于这一类[12]。

下面介绍几种典型的电泳:

1、醋酸纤维素薄膜电泳

　　醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

醋酸纤维素薄膜分步电泳法不仅快速简便 ,检测灵敏度高 (检出限 0.1g/L) ,还可以进行定量分析 ,尤其可以同时检测多个样品 ,简便快速、 成本消耗低 ,可以作为 HP生产厂以及国家药检部门 HP原料药质量控制的常规检测方法[13]。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

自从1959年Raymond和Weintraub首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是60年代初Hjerten和Ornstein和Davis发表他们的不连续电泳系统的基础工作以来，聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验室最常用的支持介质。由于它的分子筛效应，提高了电泳分离率，不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，诸如电荷、分子量、等电点以至于构象。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,又称天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）。它是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构想、亚甲基之间的相互作用及其生物活性[14]，因而根据其电泳迁移率，可得到天然蛋白质的分子量[15,16]。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有以下三个优点：

1） 可以在天然状态分离生物大分子；

2） 可分析蛋白质和别的生物分子的混合物；

3） 电泳分离后仍然保持生物活性。

使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质的分离，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。在连续缓冲系统中，主要取决于电荷密度；在不连续缓冲系统中，由于介质的分子筛效应，后二者有较大影响，见图。

蛋白质分子在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素

酸性天然凝胶电泳可以研究ＨＩＶ进入抑制剂ＡＤＳ－Ｊ１的作用机制，进而研究艾滋病的防治[17]。

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE），简称SDS电泳，主要用于测定蛋白质亚甲基分子量。与光散射、渗透压、超离心（沉降平衡技术）及层析方法（凝胶过滤）相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简单，能在几小时内得到结果，有较高的重复性，且不需要非常纯的样品（取决于样品的组成和对结果的要求），是目前为大家所接受的用于测定亚基分子量的一种最好方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，用于变性蛋白的分离以及仅仅溶解在离子去污剂中的膜蛋白和用层析方法分离的蛋白和酶的纯化控制。在临床实验室，尿蛋白的SDS电泳分析已被公认是肾脏疾病诊断的有用的工具[18]。

对于小鼠脑蛋白的 S D S — P A G E银染， 常规方法中， 用玻璃 平皿效果最好，医用搪瓷盘次之，密胺塑料盘最差[19]。

采用明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析与衰老相关的内肽酶同工酶。通过改变电泳分离胶中底物蛋白质浓度，可以使正染的蛋白质蛋白质标准条带和负染的内肽酶条带同时显现出来，从而了解内肽酶的表征分子量[20]。

4、等点聚焦电泳

等电聚集，缩写为IEF或EF，是60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段。30多年来发展很快，成为当前一向电泳中具有最高分辨率的技术。它的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。所以利用等点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。根据建立pH梯度原理的不同，梯度又分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。后者是将缓冲基团成为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级[21]。

5、双向电泳

双向电泳广义的定义是将样品进行电泳后，为了不同的目的在它的直角方向再进行一次电泳，如表：

双向电泳的种类

但是目前双向电泳大都是指第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点，分子量等信息。分离的结果不是带，而是点。根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子量的增加。这是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息最多的技术。

优点：蛋白质双向凝胶电泳是目前 唯 一可以从等电点和分子质量两方面将数千种蛋白质同时分离与展示的技术，因而具有较高的分辨率和灵敏度已成为蛋白质组学研究中的主要技术手段.目前,已报道的双向电泳方法大多采用[22].

缺点： 它需要手工制胶和染色，导致分析时间 过长，难以满足在线、快速、自动分析的要求[23]。

血清作为一种复杂的体液成份，含有小分子、盐、 蛋白质等多种物质 ,而血清蛋白组分的改变能够新方法。血清中存在的大约10 000种蛋白 ,目前仅有 1 500 多个得到鉴定 ,这表明目前对血清蛋白了解还十分有限。因此 ,血清蛋白组学具有广阔的研究及应用前景。

双向电泳是蛋白质组学研究的核心技术之一。提高分辨率和重复性是双向电泳最重要的两个技术目标 ,而样品处理在实现以上目标过程中起到了核心作用。目前还没有一种能广泛应用于各种生物样品制备的方法。分别对血清进行处理 ,通过比较电泳结果 ,分析对血清双向电泳结果的影响 ,可以为双向电泳技术的优化提供参考[24]。

6、免疫电泳

免疫电泳技术是基于抗原的电泳迁移以及与抗体的专一性免疫沉淀反应。在大部分电泳中，样品中的抗原通过含有相应抗体的pH8.6的薄层琼脂糖凝胶，抗原在pH8.6时通常带强负电，而抗体在此pH不带电，不能迁移。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。最初抗原过量，所以仅仅产生可溶性的免疫混合物，与抗原一起向阳极迁移。当抗原和抗体的浓度达到当量点时就形成大的、不溶性的免疫沉淀。各种免疫电泳沉淀的形状不同，大部分是锥体或火箭状，坐落于样品孔上。见图锥体的高度或面积与样品中抗原的量成正比。

免疫分析的最大应用领域是人血蛋白的研究。许多疾病都是由于血中一种或多种蛋白质浓度或结构的改变所致。一些体液如：脑脊液、乳汁、肠液、唾液、腹水、胸膜液等，虽然其中蛋白含量很少，也能用免疫电泳方法测定。体外蛋白，如疾病产生的有机物质，也是研究的对象。在农业，食品，法医学研究中，主要用于不同来源蛋白质的比较，即分类学研究。在基础研究工作中，由于抗原-抗体反应的高度专一性，例如凝胶过滤后收集的蛋白质成分纯度的测定，蛋白-蛋白，蛋白-配体相互作用的研究都能使用免疫电泳技术[25 、26]。

三、毛细管电泳

毛细管电泳(CE)以毛细管为分离通道,高压直流电场为驱动力, 根据组分的淌度和分配系数的差异进行分离。集成芯片毛细管电泳是 2 0世纪9 0年代初发展起来的一种低耗、 高通量、 高信息、 高速度、 高灵敏 度、 高选择性及高效能的集分离测定于一体的电泳技术 [27]。

分离电压是毛细管电泳的一项重要参数，增加分离电压，毛细管轴向的电场强度增强，可改变分离度和分析时间：但在升高电压的同时，电流通过缓冲溶液产生的焦耳热将增加，毛细管内缓冲溶液 温度升高，使其溶液的黏度减 小，引起柱效和分离 度的降低，待测物迁移时间的波动[28] 。

毛细管电泳的特点：体积小；侧面/截面积比较大，因而散热快、可加高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质。

优点：高效、快速、微量、多模式、样品对象广、经济、自动、洁净。

缺点：制备能力差；光路太短，非高灵敏度的检测方法难以测出样品峰；需要发展专门的技术来制备包含凝胶等不流动介质的毛细管；大的侧面/截面积比能放大吸附作用，导致蛋白质等样品的分离效率下降或无峰；吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚无定量控制电渗的方法。为克服毛细管电泳重现性差的缺点，可采用内标法定量[29]。

毛细管电泳的基本原理就是电泳和色谱。电泳和色谱的原理是如此地不同，但形式却又惊人地相似，因此它们一直交缠发展，分分合合。

电泳与色谱的相同点：

（1）分离过程相类 电泳和色谱分离都是差速过程，都可用物质传输等理论来描述。

（2）仪器构成类同 电泳和色谱系统通常都包括有进样、分离、检测和数据处理等部分。

（3）分离通道的形状类似 有薄层、柱子、毛细管等[30]。

不同点：

产生溶质移动速度差的原理不同：色谱是一种浓差驱动传质的平衡分离法，而电泳法是外力作用下的差速分离法[31]。

发展

高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）技术是一种新型高效液相分离技术，具有快速、高效、高灵敏度、重复性好、易定量、非同位素操作、可实时监测及全自动化等优点，广泛应用于化学、生物学、医学、环境卫生等各个方面，尤其是用于生物医学，如甄别人类遗传性基因缺陷、对基因进行定量分析、微生物学和病毒学分析、法医分析、基因治疗等。目前，在临床检验中HPCE主要用于检测糖、蛋白质、核酸等[32]。

芯片毛细管电泳自1992年由Manz首次报道以来迅速发展,它将微流控芯片的集成化技术与 CE的分离检测技术相结合,在石英、玻璃或塑料等基片上刻制微通道,实现样品的处理、 分离及检测等,比 CE分析速度更快。CE和MCE具有高效、快速微量、经济、污染小和分析样品范围广等特点,现已应用于医学研究、食品分析、环境分析、药物分析、蛋白质分析、手性分离及单细胞分析等领域中。CE和MCE的分离通道内径狭小、分析速度快, 要求检测器灵敏、快速、 微型化和集成化, 检测器成为了研究重点之一[33]。

检测：将耦合电导检测芯片与毛细管无死体积连接的方法易用于常规的毛细管电泳系统之中．由于该检测方法可直接检测溶液组分的物理特性参数而不受系统的尺度缩小及操作条件的影响，因此可能成为微纳流控芯片电泳的重要检测手段[34]．

作为毛细管电泳的一个分支——非水毛细管电泳，与经典的水相毛细管电泳相比，具有分析对象范围广、分离效率高和吸附少等优点。近年来，非水毛细管电泳已引起分析工作者的广泛重视，如食品包装材料中酚类环境激素[35]。有文献报道利用非水毛细管电泳法同时测定肉桂酸和肉桂醛，但因检出限高、灵敏度低使该方法的应用受到了一定的限制。为了提高检测灵敏度和改善选择性，采用柱前和柱后衍生化是一种行之有效的手段[36]。

联用技术

在诸多检测技术中, 紫外可见吸收、荧光检测 ( F l uorescence detection ,FD)等光学检测技术应用较为普遍。电化学发光检测、安培检测电位检测[37]、接触式电导检测和非接触电导检测(Contact less conduct i vi ty detection , CCD)等电化学检测技术以灵敏度高、选择性好、装置简单等优势受到重视。质谱(MS)自 1987年首次报道用于 CE检测以来,在 CE和 MCE中已有应用, 并随着接口技术的发展, 显示了它的发展潜力[38]。此外还有拉曼光谱、核磁共振等多种新型检测技术,各自具有独特优势和适用范围。虽然检测方法多样,但是单检测技术仍存在一定的局限性,在分析测定样品时, 需要根据分析物的性质和检测灵敏度来选择合适的检测方法,如 FD法只适用于测定具有荧光发色基团或经过衍生后具有荧光特性的物质;安培法适用于测定具有电化学活性的物质;而电导法擅长于测定荷电成分。当样品成分较复杂时,只使用单一检测法无法一次分析测定多种性质样品, 而将两种或多种检测方法联用, 可以发挥各自的优势,相互补充, 能一次检测更多种类物质,避免了多次测定, 降低分析成本[39]。除了上述联用外，还有双电泳技术质谱联用[40、41]、双向电堆积与毛细管电泳联用等[42]。

应用

1、 药物成分分析

　　CE对药物及其制剂的成分分析，主要用于新药研究和开发、药品生产过程中的质量控制、药物制剂分析等。

1.1化学药剂及其制剂

常规分析方法能基本解决定性定量和纯度控制，但某些结构特异、性质特殊的品种仍有一定困难。CE技术恰能解决某些分析手段的不足，相关应用报道越来越多。如封宇飞等［43］ 采用毛细管区带电泳法，快速测定氯霉素滴眼液中氯霉素与二醇物的含量，用于药品生产过程中的质量控制.　

1.2中药及中药制剂

　　毛细管电泳法在中药及中药制剂方面的运用亦有相关报道［44］。中药有效成分更为复杂，不同中药品种的活性成分含量相差悬殊，复方制剂尤甚。CE法为中药分析提供一种新的方法，目前已能对中药中主要有效成分如生物碱、有机酸类、黄酮类、香豆素类及各种苦类进行相关分析。

CE用于中药制剂方面，作为其质量控制方法，可更好促进其规范化生产，如魏惠珍等［45］建立了一种用CE测定元胡止痛片和元胡止痛口服液中延胡索乙素含量的方法，可用作质量控制方法。

1.3手性药物的分离

手性药物对映体的分离在药物控制、对映体的生物活性和药理作用研究等方面有非常重要的意义。胡兵等［46］用HPCE法，快速准确测定罗格列酮钠中2种异构体的含量，可用于其手性分离的方法.

2、用毛细管电泳电化学淌度移动法还可以测定物质之间的结合常数，进而快速、灵敏地实现物质的检测[47]。

3、p53基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用 ,用毛细管电泳法检测基因点突变的研究将有助于临床准确诊断肺癌[48]。

4、建立了测定了人血清中肿瘤标记物 C E A的微流控芯片电泳激光诱导荧光均相非竞争免疫分析新方法。可用于临床上癌症的快速诊断[49]。

5、目前三 聚氰胺的检测方法主要包括液相色谱法( L C)、液相色谱- 质谱法( L C — MS )、气相色谱法( GC ) 和气相色谱一 质谱法 ( G C - MS )及免疫学法。L C是 目前最常用 的测定方法， 但都有一些缺点。毛细管电泳是近十年来蓬勃发展的一种检测方法 ， 因其具有 分离效率高且经济环保的特点，已广泛应用于医疗和食品安全检测领域[50]。

展望

综上所述，CE技术由于其分离效率高、快速、检测手法多、应用面广，已在药物分析中占有重要地位， CE法在体内药物分析、中药分析方面仍有许多空白，有待进一步深入研究。在应用过程中从总体来说CE 还处于发展阶段，目前HPLC法仍然是药物分析的主要手段， CE可以与传统分析方法取长补短，配合使用，相互验证。如何与其他技术更好地联合使用，达到更佳效果，仍是CE研究的新课题、新方向。目前CE已发展有几种新的分离模式，芯片毛细管电泳（CCE）、阵列毛细管电泳（CAE）、亲和毛细管电泳（ACE）、毛细管电泳仪与其他仪器的联用CE-MS，CE-NMR等，所有这些发展都将使CE技术日臻完善。

总 结

由于电泳法有操作简单,设备便宜,分辨率高,易于多个样品分析,灵敏度高,易于特异检测,能给出结合图谱等一系列的优点，所以在实验中广泛的用于分离分析。今后随着毛细管电泳法的进一步发展，以及与其他技术的联用，电泳法会显示出更加巨大的生机和活力。电泳法的鼻祖Tiselius教授在他的序中最后提到：电泳方法的发展及其应用是物理方法在生物化学和生物学问题的应用中的一个具有成果的不平常的范例。他的这段结论与希望正在得到证实和实现。

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