植物分子生物学实验技术

植物分子生物学实验技术

班 级：研122班

专 业：作物生物技术

姓 名：陕建国

学 号：20122419

授课教师：红英老师

实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论

一、提取植物DNA和RNA的用处

提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。

（一）提取植物DNA的用处

DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。

（二）提取植物RNA的用处

提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。

二、植物组织DNA的提取方法

提取植物DNA的试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

（一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间）

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／L HCl。

10、0.2mol/L NaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。

12. 1.0mol/L 高酸溶液（HClO4）。

13、高氯酸溶液。

14、0.05mol/L NaOH。

15、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/L NaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml 1mol/L HClO4，混合冷却后用0.5mol/L HClO4定容至刻度，则得100μg/ml 的标准溶液。

实验步骤 ：

1、 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、 将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L 高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、 再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、 用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、 然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、 加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

（二）植物DNA的CTAB提取法：（来自You are so late的新浪空间）

试验步骤：

1、 称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、 将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、 取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、 将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、 转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、 加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5μl RNase置于56℃水浴中过夜。

7、 待DNA完全溶解后，加2-3ml 4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、 离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、 将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μl TE溶液中于-20℃保存.

（三）植物叶片ＤＮＡ的提取步骤（来自.everlab.net/Invite/23b2c5d6　b04a　43e2　bbfc　d1e1a002dc21）

实验步骤

1、在50ml带盖离心管（放在-20度预冷）中加入20ml提取缓冲液I，60℃水浴预热。

2、水稻幼苗或叶子5~10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30~60分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。

3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静止5~10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。

4、室温下5000rpm离心5分钟。

5、仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6、在1.5ml eppendorf 管中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

7、如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。

9、加入5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃ 10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10、加入1/10体积的3mol/L NaAc 及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。

11、用玻璃捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

12、将DNA重新溶解于1 ml TE中，－20℃贮存。

三、植物RNA的提取

植物细胞含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。

植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。

源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22μm 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。

提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。

尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。

影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化；或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。

（一）小麦叶片及不同时期种子的RNA的提取（双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法 大学生命科学学院,）

1、取510g材料放入研钵中，加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（在研磨过程中，保证材料始终浸在液氮中，研磨约30min左右）。

2、待液氮自然挥发干净后，将材料转入100ml的离心管中，加入68倍体积的裂解缓冲液Ⅰ，轻轻搅拌后，0℃冰浴20min。

3、12000r/min，4℃离心15min。

4、取上清液，加1/3体积的3mol/L醋酸钠（pH 5.3），1/5体积的氯仿-异戊醇（24:1)，轻轻混匀，0℃冰浴20min（加5倍体积裂解缓冲液Ⅱ溶解沉淀以提取DNA)。

5、12000r/min，4℃离心15min。

6、取上清，加入等体积冰浴冷却的异丙醇，混匀且冰浴10min。

7、5000r/min，4℃离心10min。将沉淀溶于5ml含有0.1%的SDS缓冲液中，加入8mil/L LiCl使终浓度至2.5mol/L，冰浴4℃过夜。

8、12000r/min，4℃离心10min。

9、70%乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥10min后，溶于DE-PC处理的TE或水中。加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。-70℃冰箱保存。

裂解缓冲液Ⅰ成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+0.1%LDS。

裂解缓冲液Ⅱ成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+1%LDS。

（二）植物总RNA的提取（百度文库）

Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。

Trizol试剂配制

苯酚饱和液（38%）-380ml/l 、硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 、硫氰酸铵（0.4M）-- 76.12g 、醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 、甘油 – 50ml ，加水至1L

实验试剂

1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 （v/v)] 、氯仿。

4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。

5、Trizol试剂。

操作步骤

1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品；

２.　每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

３、室温下静置5～１０分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离

４、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置５分钟

５、 10000r/min离心10分钟

６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。

７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下７５００r/min离心5分钟。

８、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃

（三）CTAB方法提取植物叶片RNA（百度文库）

操作步骤

1、取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

2、每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500µl β-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

3、每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min。

4、取上清，加入1∕3体积的8M LiCl和500µl β-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

5、4℃，12000rpm离心20min。

6、弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120µl β-巯基乙醇和880µl 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

7、取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

8、取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

9、取上清，加入1∕10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。

10、4℃，14000rpm离心20min。弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，每次洗涤后，14000rpm离心10min，弃上清。冰上干燥RNA沉淀。

11、加入100µl RNase-free-ddH2O溶解沉淀。取10µl稀释200倍检测UV λ230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。取5μg进行RNA样品的电泳检测，以检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于－70℃下保存。

（四）硅藻土 - 苯酚法（一种广泛适用的 RNA 提取方法）（来自晓宇的方法）

利用硅藻土能够有效吸附 RNA 酶的特性，结合高盐、PVP 及乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量 RNA 提取方法. 该方法适应性广，可以从富含 RNase 及多糖、多酚等代谢产物提取 RNA 困难的动、植物及微生物材料中提取高质量总 RNA植物组织RNA提取的难点及对策。

具体步骤：（全过程均在冰上操作，保持样品温度在 0～4℃）

1、样品液氮速冻，于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管；

2、按照4 ml/g 的比例加入硅藻土提取缓冲液，充分震荡后加入 1/2 体积的水饱和酚和 1/2 体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡混匀；

3、4℃12 000g离心 10 min，取上清加入等体积 5 mol/L KAc(pH 4.8)，混匀后冰浴10 min；

4、4℃13 000g 离心 10 min，液相转入新管，重复上述酚仿抽提，直至界面清亮；

5、上清移入新管，加入等体积乙二醇丁醚，混合均匀后，冰上放置 1 h；

6、4℃14 000 g 离心 15 min，沉淀用 75%乙醇洗 2 次，空气干燥后用适量 DEPC-H2O 溶解，- 70℃保存。

硅藻土提取缓冲液：20 mmol/L 柠檬酸钠(pH 7.0)， 10 mmol/L EDTA， 0.5% SDS，1% β- 巯基乙醇，100 mmol/L NaCl，1.9 g/L 处理过的硅藻土。(121℃高压灭菌 20 min，冷却后再加入 1% β- 巯基乙醇，4℃保存) 。

硅 藻 土 的 处 理 ： 5g硅藻土用 50 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)溶解，于 100℃放置5 min。室温2500g离心5min。弃上清，沉淀用40 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。重复离心和重悬的步骤两次。 超声 1 min。室温3500g离心15min.。沉淀用30ml 50mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。4℃储存。

实验二：PCR 及QPCR

普通的PCR是进行定性分析的，而QPCR是进行定量分析的，是检测初始量的，并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。

一、PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

（一）PCR的原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

（二）PCR反应体系（百度文库）

1、无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

2、Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。其浓度越小，酶的特异性就越高。

3、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

4、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

5、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。

6、模板：不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

7、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

(三)PCR引物设计（百度百科）

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

　　引物设计的基本原则：

　 ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　③引物部不应出现互补序列。

　　④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

　　⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

　　⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

　　⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

（四）PCR的步骤（百度文库）

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

第一步、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

第二步、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

第三步、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

（八）PCR的种类（百度文库）

二、QPCR

QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。其就是利用荧光信号的变化实施检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

（一）QPCR的原理（来自You are so late的新浪空间）

实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。

（二）Real-time qPCR的种类

荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这2种方法，其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。

第一种：非特异性SYBR Green I染料法

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（结合示意图），在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

第二种：特异性Taqman水解探针法

Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。

（三）Real-time qPCR实验设计

1. 引物设计

一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：

扩增产物长度在80-150bp

引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性

产物不能形成二级结构

产物长度一般在15-30碱基之间

G+C含量在40%-60%之间

碱基要随机分布

引物自身不能有连续4个碱基的互补

引物之间不能有连续4个碱基的互补

引物5’端可以修饰

引物3’端不可修饰

引物3’端要避开密码子的第3位

2. Real-time qPCR操作过程（百度文库）

（1） RNA提取和反转录

RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：

a.全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

b.使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。

c.在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150℃的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

（2）Mix配制

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。

（3）仪器设置

按照说明书对仪器进行设置，设置之后就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

实验三：分子克隆技术

分子克隆又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术，是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体）方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

一、分子克隆技术的基本工具

（一）限制性核酸切酶——“分子手术刀”(百度文库)

切割DNA的工具是限制性核酸切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。

1、限制性切酶的种类

根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：

第I 类限制性切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的；

第II 类限制性切酶只具有核酸切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量；

第III 类限制性切酶也同时具有修饰活性和切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。 其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。因此以下容均以II 类限制性切酶为主。

2、限制性切酶的特点

（1）识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）；

（2）具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端；

（3）由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性切酶的作用，使之不受对应的限制性切酶的切割。对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体的一种保护机制。换言之，正是由于限制性切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。

（二）DNA连接酶——“分子缝合针”

能够将两条DNA链连接起来的酶，称之为DNA连接酶。 已发现的DNA连接酶主要有两种：

（1）E·coli DNA连接酶：它是从大肠杆菌中分离得到的，它只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接；

（2）T4 DNA连接酶：它是从T4噬菌体中分离出来的。它对黏性末端和平末端都可以进行“缝合”，但连接平末端的效率比较低。

（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（百度百科）

一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors。最主要的载体是质粒、噬菌体和病毒，分别应用于原核细胞或真核细胞。从功能来分，有克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。

1、 载体一般要求

（1）能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。

（2）容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。

（3）容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸切酶位点。

（4）容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。

（5）有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。

2、载体的类型

在基因工程中通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞中。此外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等作为载体。

质粒载体的特点：①是染色质外的双链共价闭合环形DNA；

②能自主复制，是能独立复制的复制子；

③质粒对宿主生存并不是必需的。

3、常用的载体

二、分子克隆技术的基本操作步骤（来自宏主编的《基因工程原理与应用》）

（一）目的基因的获取（分、切）

目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成，具体的方法有：

1、从基因文库中获取目的基因：根据目的基因的有关信息（如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性）来获取目的基因，这是一项比较复杂的工作。

2、利用PCR技术扩增目的基因： PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，以此可以获取大量的目的基因。

3、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

（二）基因表达载体的构建（接）

构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

（三）将目的基因导入受体细胞（转）

1、将目的基因导入植物细胞（农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法）；

2、将目的基因导入动物细胞：通过卵细胞进行显微注射，将目的基因导入；

3、将目的基因导入微生物细胞：①用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。②将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

（四）目的基因的检测与鉴定（检）

1、分子检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因；

②检测目的基因是否转录出了mRNA；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质。

2、个体生物学水平的鉴定：如一个抗虫目的基因导入植物细胞后，需要做抗虫实验，以确定是否具有抗虫性以及抗虫性的程度。

三、分子克隆技术的重要意义和应用

分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

（一）在医学方面

利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。

（二）在基因治疗方面

通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。

（三）在工业生产方面

以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。

（四）在农业生产方面

植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

实验四：转基因技术

转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一，其是对传统技术的发展和补充。将两者紧密结合，可相得益彰，大大地提高动植物品种改良的效率。

一、转基因技术概念

转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。转基因技术就是把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。常用的方法和工具包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组（一般为模式生物，如拟南芥或斑马鱼等），观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能的目的。

二、转基因的分类（百度百科）

转基因按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因和动物转基因。具体介绍如下：

1、人工转基因

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically modified organism，简称GMO）。　

2、自然转基因

不是人为导向的，自然界里动物或植物自主形成的转基因。　

3、植物转基因

植物转基因是基因组中含有外源基因的植物。它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中得到表达。　

4、动物转基因

动物转基因就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，转基因超级鼠比普通老鼠大约一倍。生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。

三、转基因技术的方法（百度文库）

由于我们专业是研究植物的，所以这里主要罗列一些植物的转基因技术方法。常用的植物转基因技术的方法有：

1、农杆菌介导转化法

农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。

农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中。

农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。

农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段明显及实验费用低等优点，因此，农杆菌介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法。但是，农杆菌介导法也存在一些问题。首先，在自然条件下，农杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物，虽然可以采用人工添加酚类物质的方法，诱导农杆菌完成侵染过程，但是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前，只发现20多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次，植物细胞壁对农杆菌介导转化效果有一定影响。再次，影响农杆菌转化效率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时，研究者要考虑农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况；外植体的基因型、来源和发育状态；培养基成分及某些诱导条件如是否加入酚类物质等。此外，植物愈伤组织的诱导过程有时会存在困难。

2、基因枪介导转化法

基因枪法的原理是：利用基因枪产生的高压动力冲击波将包裹外源DNA的重金属颗粒（如钨粉、金粉等）射穿植物细胞壁和细胞膜，射入植物细胞，使外源DNA随机整合到植物细胞染色体中，达到使外源DNA在受体植物中正常表达和稳定遗传的目的。

基因枪法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA样品；(3)重金属颗粒的外源基因包被过程；(4)植物愈伤组织的前处理；(5)基因枪轰击过程；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

基因枪法具有操作方法简单，转化时间短、数量大，对受体植物几乎无要求，基因用量少，可转化基因片段大，可获得较长时间的瞬时表达，实验费用低等优点。然而基因枪法也有许多缺点。首先，由于基因枪法转导的外源 DNA是随机整合到宿主基因组中的，这不利于外源DNA在宿主植物中稳定地表达和遗传。其次，因为随机整合位点不固定和外源DNA拷贝数多等问题会导致转基因后代的突变率提高、整合的外源DNA丢失及基因沉默等现象。此外，基因枪法还存在转化过程对细胞有损害、转化率低、嵌合体多、可重复性差及设备昂贵等缺点

3、花粉管通道法

花粉管通道法的原理是：在植物授粉后的特定时期，利用精卵融合细胞、早期合子及早期胚细胞无细胞壁和核膜结构的特点，以柱头形成的花粉管为通道，将外源DNA导人受精胚囊。在受精后细胞基因组合成和复制活跃的条件下，将外源DNA随机整合到受体植株基因组上。

花粉管通道法的基本步骤是：(1)目的基因的制备；(2)根据受体植物受精后，花粉管形成的情况和精卵细胞融合的时间，确定最佳时间，进行外源DNA导入；(3)转化种子及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

花粉管通道法的优点：操作简单；对受体植物无种类的要求；对外源DNA无特别要求；无组织培养过程；转化速度较快，育种周期短等。其缺点是：该方法的具体机制不清，且缺乏分子生物学证据；受自然条件、环境条件及受体植物的花期等生理条件限制；该方法要求充分了解受体植物开花受精的时间；该方法要求很强的经验性，对某些农作物的操作难度较大；转化率低；结果的可重复性差；在转基因植株的后代中，外源基因的稳定遗传性差。

4、原生质体融合

将不同物种的原生质体进行融合，可实现两种基因组的结合。也可将一种细胞的细胞器，如线粒体或叶绿体与另一种细胞融合，此时，是一种细胞的细胞核处于两种细胞来源的细胞质中，这就形成了胞质杂种。

5、超声波介导法

作为一种新创建的物理学基因转化方法，超声波介导法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领域。在农作物基因转化研究中，超声波介导法已成功地将外源DNA转导人烟草和甜菜的原生质体、玉米和小麦的未成熟胚及烟草的叶片中。目前，该方法常与农杆菌介导法共用以提高外源DNA的转化效率。

超声波介导法的原理是：利用超声波的空化作用，在细胞膜上产生可恢复的渗透孔空洞，从而使外源DNA进入细胞。 超声波介导法的基本步骤是：(1)目标植物外植体的制备；(2)目的基因的制备；(3)超声波处理；(4)转化受体俞伤组织的筛选与植株再生；(5)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

超声波介导法的优点有：该方法不受宿主围的限制，可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞；该方法可以避免对细胞的机械性损伤，有利于原生质体的存活；该方法操作简便、设备便宜等优点。由于超声波介导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等问题。因此，该方法也会导致转基因后代的突变率提高、整合的DNA丢失及基因沉默等现象。

四、转基因技术的应用

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。发达国家纷纷把发展转基因技术作为抢占未来科技制高点和增强农业国际竞争力的战略重点，发展中国家也积极跟进，并呈现以下发展态势：

一是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，研究手段、装备水平不断提高，基因克隆技术突飞猛进，一些新基因、新性状和新产品不断涌现。品种培育呈代际特征，目前全球转基因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合的复合性状正成为转基因技术研究与应用的重点。

二是产业化应用规模迅速扩大。截至2009年底，全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积，由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。美国仍然是最大的种植国，2009年种植面积9.6亿亩；其次是巴西，3.21亿亩；阿根廷，3.195亿亩；印度，1.26亿亩；加拿大，1.23亿亩；中国，5550万亩；巴拉圭，3300万亩；南非，3150万亩。值得一提的是，2000年以来，美国先后批准了6个抗除草剂和药用转基因水稻、伊朗批准了1个转基因抗虫水稻商业化种植；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚4国批准了转基因水稻进口，允许食用。

三是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。

实验五：转基因技术的安全问题讨论

转基因技术自20世纪70年代兴起后，在短短几十年间，得到了飞速的发展，目前已经成为生物科学的核心技术，在农牧业、工业、环境、能源和医药卫生等方面展示出美好的前景。但是，由于国际大资本家们急功近利，在转基因技术远未成熟的今天，就泛滥地使用转基因技术，造成已有的和潜在的危害也是极为巨大的，这不得不引起人们的警惕，以下就介绍一下转基因技术的安全性问题：

一、转基因生物威胁环境安全

1、地球自生命诞生之日起，经过约30多亿年的进化历程，才使自然界中的生物处于现在这样和谐的动态平衡之中。而今天，当人们利用生物技术把动物、植物、微生物的DNA组合在一起，转移到某种生物中时，这种做法势必会打破自然物种的原有界限，改变生态系统中能量流动和物质循环。使生态系统的稳定性遭到破坏。如 2006年8月4日 中国科学院官方所发布消息：中美两国科学家进行的一项历时7年的联合研究表明，尽管转基因抗虫棉能有效控制棉铃虫，但长期种植会导致其他害虫肆虐，这使得中国种植的转基因抗虫棉长期经济性不如预想。种植抗虫棉开始虽效益大增，但从第四年开始发生逆转。转基因棉花尽管抑制了棉铃虫，但它无法杀死盲蝽等其他害虫，导致盲蝽侵害棉田。当年转基因棉花种植户杀虫剂用量上升，投入成本比普通棉花种植户高了3倍，而他们的收入却低了8%。到第七年，转基因棉花种植户所使用的杀虫剂，已明显高于普通棉花种植户，加上转基因棉花种子成本也较高，使棉花种植户的收入大幅下降。

2、转基因的微生物在降解某些化合物过程中所产生的中间产物，可能会对人类生活环境造成二次污染，有人报道，一些用来降解塑料消除污染的转基因微生物就是如此。

3、重组的DNA进入水体或土壤后能存活多久？流向何方？在现有的技术条件下很难追踪。因此，如果这些重组DNA与微生物杂交，有可能产生出对动植物和人类有害的新的病原微生物。

4、如果转基因植物的花粉中含有毒蛋白或过敏蛋白，通过蜜蜂的采集，很可能进入蜂蜜中，再经过食物链的传递，最后可能进入其他动物和人体。

二、转基因生物威胁生物安全

1、科学家赋予了转基因生物某些特殊性状，如抗虫、抗旱、抗冻、生长快、植株健壮等等。增强了它们的生存竞争能力，有可能使它们成为“入侵的外来物种”，威胁生态系统中其他生物的生存。突出的例子如在我国南方大面积种植的转基因速生桉树，生长速度奇快，吸收大量的水分和营养，使土地变瘦变干，造成其他生物大量死亡，在速生桉生长过的地方，几乎寸草不生、飞鸟走兽绝迹。严重破坏生态环境，有人称它为“亡国之树”。

2、导入转基因生物的外源基因有可能与感染转基因生物的某些细菌或病毒杂交，从而重组出对人类或其他生物有害的病原体。在20世纪90年代，乌干达国家的木薯业曾遭到病害的毁灭性打击，研究发现就是一种新型病毒引起的，这种新型病毒是由两种已知病毒重组产生的。

3、转基因植物的抗除草剂基因，有可能通过花粉传播而进入杂草中，使杂草成为难以除掉的“超级杂草”。现在有十多种“超级杂草”正在美国22个州至少上百万公顷农田中肆虐。这些农田都种植了上文所说的孟山都公司的抗除草剂转基因作物，如今农作物的抗除草剂基因通过花粉传到了杂草，这些草天天可以长七八厘米，最高能长到 两米 多，把农作物全都盖在底下，见不到阳光。这种粗壮的杂草十分硬朗，收割机常常被它们打碎。所有的除草剂对这种超级杂草都是杯水车薪，难以遏止。

4、转基因植物的外源基因，还有可能通过花粉传播到同类植物身上进行授粉，造成众多非转基因植物受到基因污染。比较突出的例子如墨西哥玉米，墨西哥本是玉米的来源地和品种多样性集中地，自从引进了美国的转基因玉米后，造成如今95%的野生玉米遭受基因污染，宝贵的玉米资源被破坏；又比如我国的大豆，中国也是大豆的起源地和品种多样性集中地，有6000余份野生大豆品种，占全球的90%以上。但如今我国每年进口大量的转基因大豆，一些不清楚的农民用于种植，造成的基因污染严重破坏了我国大豆的多样性资源。

三、转基因生物与食品安全

1、转基因食品的支持者认为：转基因农作物中只要某些重要成分没有发生改变，就可以认为与天然品种“没有差别”（即是美国原总统老布什替孟山都公司推广转基因食品所说的“实质性等同”概念）。因此不必再进行安全性检测。但是反对者认为，对食物安全性检测不仅要检测其主要成分是否发生改变，还应包括其他方面的测试结果。例如，转基因番茄，除测定其成分没有改变外，还应测试人们食用后机体的代谢指标。

2、担心出现滞后效应。转基因植物的DNA经过重组后，有可能合成出对人体有直接毒性或潜在毒性的蛋白质。转基因农作物所表达的某些蛋白质，可能会潜移默化地影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的伤害，食用者可能在当时未发现危害，在过了若干年甚至一两代人之后，问题才显现出来，那时已经晚了。

3、担心出现新的过敏源。转基因植物合成的某些蛋白质，也许大多数人食用后没事，但是具有过敏体质的人群，食用后可能会产生严重后果。美国政府防疫中心于2008年10月和2010年1月发布报告说：2007年，大约有三百万18岁以下青少年患有各种过敏症，其中包括食品过敏。报告说：与1997相比，2007年，18岁以下青少年患有食品过敏症的案例增加了18%；从1997年到2006年，少儿食品过敏案例显著增加。而1996年正是转基因食品在美国商业化上市开始之年。这说明转基因食品很可能是导致过敏症突然增多的罪魁祸首；2011年9月初，在雀巢公司在中国销售的一种婴儿食品中，国际环保组织“绿色和平”也曾发现过潜在的导致过敏的转基因成分。 4、担心营养成分改变。转基因农作物尽管只是部分DNA发生了重组，但是，有些基因足以使植物体某些代谢途径发生变化，这可能会导致转基因农作物营养成分的改变。

四、转基因生物威胁国家安全

1、如上所述，转基因生物可以破坏环境，造成生态灾难，这些都有可能威胁一个国家的安全。

2、发达国家可以依靠转基因作物的种子以及相关的配套产品，轻易地控制不发达国家的一些经济命脉，使不发达国家俯首称臣。如上述的某些印度地区，年年必须购买美国公司的转基因棉花种子和配套的除草剂，棉花产业严重受控于美国；又如阿根廷，全国48％的土地被用来种植转基因大豆，其中90％以上是美国孟山都公司的转基因大豆品种，而种植这种大豆同样必须要用孟山都公司提供的种子和农药。孟山都公司在专利费上所持的态度强硬，因此仅仅十年时间，在技术进步的名义下，阿根廷的粮食自给能力逐渐丧失，整个国家的农业经济彻底受控于外国权势集团。

3、目前，有一些国家对用转基因技术制造全新的致病菌表现出极大的兴趣，这些致病菌由于人类从来没有接触过，可以让大批受感染者突然发病，而又无药可医，这样，施放者便可以在敌方公众中造成极度恐慌，致使受害国一切活动瘫痪，从而轻而易举地达到不战而胜的目的。有报道说有的国家已经研制出新型的鼠痘病毒，由于人类目前还没有相应的有效治疗药物，因此感染者必死无疑；有人对一些病毒进行基因改造，使具有某种易感基因的民族才会感染这种病毒，施放国的人却不易感染。2003年“非典” 肆虐的时候，俄罗斯医学科学院院士卡雷辛柯夫曾经断言，非典型肺炎是一种生物武器。他的依据是：非典是麻疹病毒与流行性腮腺炎病毒的混合体，而这种混合病毒只有在实验室里才可能培育出来，在自然环境中根本不可能发生。华人比其他民族的人容易感染非典，且死亡率也远高于其他国家甚至远高于中国的近邻日本。从世界卫生组织公布的数据看，截至 2003年7月11日 ，全球非典累计确诊病人为8437人，而非典累积病人集中在中国地以及香港、澳门和等地，加上华人比较集中的新加坡，合计7960例，再加上加拿大华人非典确诊病人，共占全球非典确诊病例的96％以上。世界上包括美国在的其余地区，合计却不足400例。全球非典累积死亡人数为813人，中国地、香港、澳门、以及新加坡为762人，如果再加上加拿大华人死亡病例，华人的死亡率高达96％！ 这一切还不能引起我们的怀疑和警觉吗？

4、转基因的食品同样可以制造成为“基因武器”，诱惑敌对国家种植、食用，缓慢地影响敌对国家人们的身体素质，可能因武器”食品，同样可以针对敌对国家民族特定的的基因弱点来改造，只有敌对国家民族的人食用后才会发生危害，对于其他国家民族的人来说却是安全的。用这样的转基因食品作为武器，足以在不知不觉中轻易毁灭一个国家民族。在如今地球人口日益增多、环境日益恶化、资源日益枯竭之时，帝国主义的众多“精英”纷纷提出要消灭一部分地球人口，我们决不可掉以轻心啊。

五、转基因食品的利与弊

优点：

1.摆脱四季供应的局限

转基因食品可以摆脱季节、气候的影响，让人们一年四季都可吃到新鲜的瓜菜。同时，人们还发现转基因作物结出的果实，无论外形还是味道都别具风味。英国的科学家将一种可以破坏叶绿素变异的基因移植到草中，可以使之四季常青，除了具有绿化功能之外，还使畜牧业受益，因青草的营养比干草高，而使肉的质量提高。

2.大大缩短育种时间。

过去改变植物的品种主要是通过育种，这种传统的育种方式需要的时间长，杂交出的品种不易控制，目的性差，其后代可能高产但不抗病，也可能抗病但不高产，也许是高产但品质差，所以必需一次一次地进行选育。而转基因技术就不同了，可以选择任何1个目的基因转进去，就可得到1个相应的新品种，不用再花那么长的时间筛选了。

3.减少农药使用，避免环境污染。

转基因技术可以减少农药使用，避免环境污染。例如：马铃薯植人天蚕素的基因后，抗清枯病、软腐病的能力大大提高，过去这两种病每年会带来近3成的减产，一种抗科罗拉多马铃薯甲虫的马铃薯，可使美国每年少用37万kg的杀虫剂；阿根廷播种转基因豆种后，大豆抗病和抗杂草能力大为增加，使用农药和除草剂的量减少，生产成本比原来下降了15％。

4.节省生产成本，降低食物售价。

通过转基因技术可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性的作物新品种，以减少对农药化肥和水的依赖，降低农业成本，大幅度地提高单位面积的产量，改善食品的质量，缓解世界粮食短缺的矛盾。

5.增加食物营养，提高附加价值。

利用转基因技术生产有利于健康和抗疾病的食品。杜邦和孟山都公司即将推出多种可榨取有益心脏的食用油的大豆。两大公司还将联手推出味道更鲜美且更容易消化的强化大豆新品种。艾尔姆公司与其他公司合作，正在研究高含量抗癌物质的西红柿，以及可用于生产血红蛋白的玉米和大豆。此外，含疫苗的香蕉和马铃薯也正在加紧研究中；日本科学家利用转基因技术成功培育出可减少血清胆固醇含量、防止动脉硬化的水稻新品种；欧洲科学家新培育出了米粒中富含维生素A和铁的转基因稻，这一成果有可能帮助降低全球围、特别是以稻米为主食的发展中国家缺铁性贫血和维生素A缺乏症的发病率。

6.增加食物种类，提升食物品质。

传统的育种只能是水稻对水稻，玉米对玉米，进行杂交，不能水稻对玉米，水稻更不能和细菌进行杂交。而转基因技术不但可以把不同植物的基因进行组合，而且还可以把动物的基因，甚至人的基因组合到植物里去。比如：科学家看中了一种北极熊的基因，认为它有抵抗冷冻的作用，于是将其分离取出，再植入番茄之中，培育出耐寒番茄。利用转基因技术，把生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等外源基因导入动物的精子、卵细胞或受精卵，可培育出生长周期短、产仔多、生蛋多、泌乳量高，生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性的动物，目前已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。

缺点：

1.可能含有有毒物质和过敏原。

科学家研究发现，有些转基因生物产品可能含有有毒物质和过敏源，会对人体健康产生不利影响，严重的甚至可以致癌或导致某些遗传疾病。尽管到目前为止还没有有说服力的研究报告表明这些改良品种有毒，但一些研究学者认为，对于基因的人工提炼和添加，可能在达到某些人们想达到的效果的同时，也增加和积聚了食物中原有的微量毒素。这种毒素的积累是个相当长的过程，但它确实可能正在进行中，因此目前谁也不能确保这些改良品种没有毒。

2.造成基因污染，污染生态环境。

大量的转基因生物进入自然界后很可能会与野生物种杂交，造成基因污染，从而影响到生物多样性的保护和持续利用，这种污染对环境及生态系统造成的危害比其他任何因素对环境造成的污染都难以消除。例如：抵抗除莠剂的转基因油菜会使野生芥菜受到传染，从而使野生芥菜对除杂草措施不敏感。

3.对非目标生物误起作用。

有些作物插入抗虫或抗真菌的基因可能对其它非目标生物起到作用，从而杀死了环境中有益的昆虫和真菌。有科学家在实验室里做了这样一组对照实验，用抗虫转基因的玉米分别饲喂玉米钻心虫和草蛉，实验结果表明，在钻心虫的死亡率高达60％的同时，草蛉的成熟期也比正常时间晚了3天。草蛉是一种益虫，被农民大量繁殖以防治棉铃虫和蚜虫等农业虫害。这个实验证明，抗虫转基因玉米没有识别益虫和害虫的能力，它在毒杀害虫的同时，也损害了益虫。若大规模地种植抗虫作物可能意味着减少有益昆虫的种群。

虽然转基因食品存在的问题很多，但世界普遍存在很多支持者。虽然目前尚未有具有说服力的试验证明转基因食品的危害性，但不能完全信任转基因食品，我们必须建立完善的管理监督机制使转基因食品正常发展。

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