首页 > 正在进行安全检测...

正在进行安全检测...

发布时间：2023-11-16 00:16:04 来源：文档文库

小中大

字号：

手机查看

WesternBlot内参选择要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是WesternBlot。因为WesternBlot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候WesternBlot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做WesternBlot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。内参即是内部参照(InternalControl，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WesternBlotting实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用WesternBlot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，WesternBlotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Westernblotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。在WesternBlotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三种。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/150c59a8dd3383c4bb4cd270.html