gentleMACS实验操作步骤中文

gentleMACS™ 操作步骤

1.背景信息

在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™ 分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。

2. 分离小鼠脾脏的操作步骤

2.1 需要的试剂和仪器

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407)

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)

2.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).

1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:

1–2 个小鼠脾脏: 3 mL

3–4个小鼠脾脏: 6 mL

5–6 个小鼠脾脏: 9 mL

2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

3. 开机，选择合适的分离程序：

1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.

3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.

4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_01. 或 m_spleen_04.

5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

6. (可选) 以 300×g 室温下离心2分钟。

7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。或者将细胞悬液通过一个细胞过滤网（3-6个小鼠脾脏），该滤网放置于50mL试管中。

8.用5 mL 缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器

9. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。

10.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。

3.用胶原酶分离小鼠脾脏的操作步骤

3.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407)

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。

● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.

● 胶原酶D溶液：用HEPES液配置终浓度为100mg/mL的胶原酶D溶液。

● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液

3.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).

1. 将1-2个小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入4.9mL HEPES缓冲液，同时加入100uL胶原酶D溶液（终浓度为2mg/mL）

2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

3. 开机，选择合适的分离程序: m_spleen_02.

4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_02.

5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

6. 37°C孵育30分钟

7. 在C管中加入12.5-25uL的DNaseI溶液（终浓度为50-100U/mL）

8. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_spleen_03.

10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。

12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器，该预分选滤器放置于15mL管子中。

13.用5 mL HEPES缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器

14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。

15.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。

4.用胶原酶分离小鼠肺组织的操作步骤

4.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)

● 细胞过滤网，70 μm筛网

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。

● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.

● 胶原酶D溶液：用HEPES液配置终浓度为100mg/mL的胶原酶D溶液。

● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液

4.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 110–150 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).

1.在一个含有PBS(ph7.2)的培养皿中解剖小鼠肺组织并清洗之。

注:确保从小鼠肺组织中去除胸腺，心肌，输出神经，血管，气管，结缔组织等。

2. 将1个小鼠肺，最多3个小鼠肺组织转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入4.9mL HEPES缓冲液，同时加入100uL胶原酶D溶液（终浓度为2mg/mL），以及10uL DNase I溶液（1个小鼠肺组织）或者20uL DNase I溶液（2-3个肺组织）（DNase I终浓度：1个肺：40U/mL;2-3个肺：80U/mL）

3. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

4. 开机，选择合适的分离程序: m_lung_01.

5. 运行 gentleMACS 程序 m_lung_01.

6. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

7. 将C管放置在MACSmix试管旋转仪上，37°C孵育30分钟。或者每隔5分钟，手工摇匀C管，重悬沉淀的组织块。

8. 反应结束后，将C管倒置在gentleMACS 分离器上

9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_lung_02.

10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。

12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个70 μm的细胞过滤网，该过滤网放置于50mL管子中。

13.用5 mL HEPES缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器

14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。

15.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。

5.用胶原酶IV分离小鼠肝脏的操作步骤

5.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)、

● 红细胞裂解液（130-094-183）

● 细胞过滤网，70 μm筛网

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。

● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.

● 胶原酶IV溶液：用KRB溶液制备含5000U的胶原酶IV溶液。（如胶原酶IV C5138,Sigma-Aldrich）

● DNase I溶液：用KRB溶液制备终浓度为30000U/mL的DNase I溶液

● 0.5M CaCl2溶液

● 0.2M MgCl2溶液

● Krebs-Ringer-Buffer(KRB)溶液：154mM NaCl, 5.6mM KCl,5.5mM葡萄糖，20.1mM HEPES,25mM NaHCO3,用NaOH调节PH值至7.4

5.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 一只小鼠肝脏的重量约为 750–1200 mg (CD1鼠, 8周龄).

▲ 每C管能够处理一只小鼠肝脏

1.在C管中加入4.4mL KRB溶液，20uL CaCl2，50uL MgCl2,500uL 胶原酶IV和25uL DNase I溶液，制成酶解液

▲注：为了保证胶原酶的效果，建议实验当天配置酶解液。

2．在37°C下孵育酶解液30分钟

3. 用KRB溶液漂洗小鼠肝脏

注:确保从小鼠肺组织中去除胸腺，心肌，输出神经，血管，气管，结缔组织等。

4. 将小鼠肝脏转移到gentleMACS C 管中

5. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

6. 开机，选择合适的分离程序: m_lLiver_01.02

7. 运行 gentleMACS 程序 m_liver_01.02

8. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

9. 将C管放置在MACSmix试管旋转仪上，37°C孵育30分钟。

10. 反应结束后，将C管倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

11. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_liver_02.02

12. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

13. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心，收集管底的细胞标本。

14.用PEB缓冲液清洗50mL试管和100um筛网的细胞过滤网，弃去PEB缓冲液，将预湿的细胞过滤网放置在试管上。

15.重悬细胞，将细胞通过细胞过滤网。用5mLPEB缓冲液洗涤C管后通过细胞过滤网。最后用10mLPEB缓冲液洗涤细胞过滤网。

16.弃去细胞过滤网，并在细胞标本中再加入10mLPEB缓冲液。

17.在4°C，以17-21g离心4分钟，去除污染的肝细胞。

18.收集上清组分，转移到一个50mL试管中，试管预先用PEB缓冲液漂洗过。

19. 在4°C，以300xg离心10分钟后，完全去上清。

20.用1mL PEB缓冲液重悬细胞，加入10mL 1X红细胞裂解液。

21.室温下孵育5分钟

22.孵育结束后，加入30mL PEB缓冲液，在4°C，以300xg离心10分钟后，完全去上清。

23.用1-2mL PEB缓冲液重悬细胞团块，最后用PEB缓冲液调整体积至30mL.

24. 在4°C，以300xg离心10分钟后，完全去上清。

25.用PEB缓冲液重悬细胞至合适体积，用于后续应用。

6.从种植的小鼠体内肿瘤组织中制备单细胞悬液的操作步骤

6.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)、

● 细胞过滤网，70 μm筛网

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。

● RPMI 1640 (# 130-091-440)

● Collagenase I 溶液: 用PBS制备含10,000 U/mL Collagenase I 的溶液(如 Collagenase I, Sigma-Aldrich, # C0130)

● Dispase II 溶液: 用PBS制备含32 mg/mL Dispase II 溶液(如 Dispase II, Roche, # 04942078001)

● DNase I 溶液: 制备含 5 MU/mLDNase I 溶液(如. DNase I, Calbiochem, # 260913)

6.2.步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 当使用MACSmix™ 试管混匀器时, 以持续运转模式进行操作，转速约为12 rpm。或者每隔5分钟手工摇匀。

▲ 在下列的操作步骤中，每C管处理0.2-3.5g肿瘤组织。

（1）从小鼠B16黑色素瘤组织中制备肿瘤浸润淋巴细胞

1. 将肿瘤组织切成大小约为5mm的小块

2. 将切成小块的肿瘤组织转移到含有5mL PEB缓冲液的gentleMACS C 管中

3. 拧紧C 管盖子，倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注：必须确保组织块在转子区域

4. 开机，并选择gentleMACS 程序 m_impTumor_01.

5. 运行 gentleMACS 程序 m_impTumor_01.

6. 程序结束后，把C管从gentleMACS分离器中取下来

7. (可选) Perform a short centrifugation step to collect the

sample material at the tube bottom.

(可选) 以 300×g 室温下短暂离心。

8. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个70 μm的细胞过滤网，该过滤网放置于50mL管子中。

9.用5 mL PEB缓冲液洗涤细胞过滤网

10. 弃去细胞过滤网，补充细胞体积至50mL

11. 室温下以300g离心10分钟，完全去上清。

12. 重悬细胞，加入PEB缓冲液至总体积为50 mL.

13. 室温下以300g离心10分钟，完全去上清

14. 用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。

（2）从小鼠B16黑色素瘤，CT26大肠癌肿瘤组织，或胰腺癌肿瘤组织中制备肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤细胞的步骤

2.2.1 从小鼠B16黑色素瘤和小鼠CT26大肠癌中制备单细胞悬液

1. 将肿瘤组织切成大小约为5mm的小块

2. 将切成小块的肿瘤组织转移到含有5mL RPMI 1640缓冲液的gentleMACS C 管中

3. 拧紧C 管盖子，倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注：必须确保组织块在转子区域

4. 开机，并选择gentleMACS 程序 m_impTumor_02.

5. 运行 gentleMACS 程序 m_impTumor_02.

6. 程序结束后，把C管从gentleMACS分离器中取下来

7.在C管中加入 150 μL of Collagenase I 溶液和150 μL Dispase II溶液

8. 将C管置于MACSmix™试管旋转仪中，在37 °C下孵育40 分钟

9. 孵育结束后，在C管中加入2 μL DNase I 溶液

10. 拧紧C 管盖子，倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注：必须确保组织块在转子区域

11. 如果分离小鼠 B16 黑色素瘤组织，选择和运行gentleMACS程序 m_impTumor_02.

如果分离小鼠 CT26 大肠癌组织， 选择和运行gentleMACS程序m_impTumor_03.

12. 程序结束后，把C管从gentleMACS分离器中取下来

13. (可选)短暂离心，收集管底的样本

14.重悬样本，将细胞悬液通过一个70 μm的细胞过滤网，该过滤网放置于50mL管子中。

15. 用5 mL PEB缓冲液洗涤细胞过滤网

16. 拿开细胞过滤网，补充PEB 缓冲液至总体积50 mL.

17. 室温下以 300×g离心10分钟，彻底去上清

18.用 PEB 缓冲液重悬细胞，加入合适的体积用于后续应用

2.从小鼠mPAC胰腺癌组织中制备单细胞悬液

1. 将肿瘤组织切成大小约为5mm的小块

2. 将切成小块的肿瘤组织转移到含有5mL RPMI 1640缓冲液的gentleMACS C管中

3. 加入150 μL Collagenase I 溶液和150 μL Dispase II溶液

4. 拧紧C 管盖子，将C管放置于MACSmix试管旋转仪上，37 °C下孵育20分钟

5. 孵育结束后，将C管倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注：必须确保组织块在转子区域

6. 开机，并选择gentleMACS 分离器程序 m_impTumor_04.

7. 运行gentleMACS程序 m_impTumor_04.

8. 反应结束后，将C管从 gentleMACS分离器中取下

9. 将C管放置于MACSmix试管旋转仪上，37 °C下孵育20分钟

10. 孵育结束后，加入2 μL DNase I 溶液

11. 将C管倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注：必须确保组织块在转子区域

12. 选择并运行 gentleMACS 程序 m_impTumor_04.

13. 反应结束后，将C管 gentleMACS分离器中取下

14. (可选)短暂离心，收集管底的样本

15. 重悬样本，将细胞悬液通过一个70 μm的细胞过滤网，该过滤网放置于50mL管子中。

16. 用5 mL PEB缓冲液洗涤细胞过滤网

17. 拿开细胞过滤网，补充PEB 缓冲液至总体积50 mL.

18. 室温下以 300×g离心10分钟，彻底去上清

19.用 PEB 缓冲液重悬细胞，加入合适的体积用于后续应用

7.从小鼠神经组织中制备单细胞悬液

7.1 需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● MACSmix™ 试管旋转仪 (# 130-090-753)

● 细胞过滤网, 如. 30 μm尼龙网筛 Pre-Separation Filters (# 130-041-407)

● MACS® Neural Tissue Dissociation Kit (P) (# 130-092-628)或 MACS Neural Tissue Dissociation Kit (T) (# 130-093-231)

● Hanks´ 平衡液(HBSS) ，不含 Ca2+ and Mg2+ (Sigma-Aldrich #H4891), 在文中称为HBSS (w/o)

● 含有Ca2+ and Mg2+的HBSS 液 (Sigma-Aldrich #H1387),在文中称为HBSS (w)

●Beta-巯基乙醇 (如Sigma, # 63689)

7.2 从小鼠神经组织中制备单细胞悬液的步骤

试剂准备：

神经组织分离试剂盒（Neural Tissue Dissociation Kits (NTDK)）的组分见下表

1. 在溶液2中加入beta-巯基乙醇 ，终浓度为0.067 mM. 如, 加入 13.5 μL 的50 mM beta-巯基乙醇 到10 mL 溶液 2中.

▲ 注: 在4 °C下能稳定保存 1 个月

2.加0.7 mL 储存液到溶液4瓶中，重悬瓶中的冻干粉，作为溶液4，不用剧烈混匀。如用于细胞培训，该溶液要过滤除菌，保存于 –20 °C 备用

3. 按照下表，准备 1950 μL 酶混合物 1 ，最多可用于400 mg 组织的酶解。 将酶混合物1加到 gentleMACS™ C 管中，用前在37 °C下预热10–15 minutes

步骤：

▲ 下列步骤中所给出的体积，均是按照制备400 mg 小鼠脑组织。如果样本重量小于400 mg, 也使用相同的体积。如果样本重量大于 400 mg, 按比例放大试剂体积和总体积。

▲ 每个C管最多能处理1600 mg 小鼠脑组织， 总体积不应超过10 mL.

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 当使用MACSmix™ 试管混匀器时, 以持续运转模式进行操作，转速约为12 rpm。

1. 在1 mL 冷的 HBSS (w/o)液中称重.

2.在gentleMACS C 管中预先加入 1950 μL 预热的酶混合物1（每400 mg组织），将小鼠脑组织转移到C管中。

3. 拧紧C 管盖子，将C管倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

4. 开机，并选择gentleMACS分离器程序m_brain_01.

5. 运行 gentleMACS 程序m_brain_01.

6. 反应结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

7. 将C管放置在MACSmix试管选择仪上，在37 °C下孵育 15 分钟。

8. 将C管倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

9. 选择并运行gentleMACS程序 m_brain_02.

10.反应结束后，取出C管

11. 每400mg脑组织，准备30 μL 酶混合物2

12. 将enzyme 混合物2 加到C管中，轻轻混匀，不要剧烈混匀。.

13. 将C管放置在MACSmix试管选择仪上，在37 °C下孵育10分钟。

14. 将C管倒置在gentleMACS分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

15. 选择并运行gentleMACS程序 m_brain_03.

16. 从gentleMACS分离器中取出C管

17. 将C管放置在MACSmix试管选择仪上，在37 °C下孵育10分钟。

18. (可选) 室温下以300×g 离心2分钟

19. 去除分离的组织，将细胞通过一个预分选滤器,预分选滤器放置在15mL试管中。

▲ 注: 当分离的组织重量超过400 mg时，使用50mL试管和细胞过滤网。

▲ 注: 如细胞直径大于30 μm, 例如Purkinje细胞或运动神经元, 可能会丢失。为了获得这些细胞，使用孔径较大的细胞筛网。

20.用 10 mL of HBSS (w)液洗涤预分选滤器.

▲ 注: 当分离的组织重量超过400 mg时，用30mL HBSS (w)液洗涤细胞过滤网。

21. 弃去预分选滤器，室温下以300×g 离心10分钟，完全弃上清。

22. (可选) 用 10 mL HBSS (w) 液重悬细胞，室温下以300×g离心10分钟， 完全弃上清。

23. 用合适的体积重悬细胞，用于后续应用。、

▲ 注：如果洗涤后，出现结实的细胞块，每毫升细胞悬液加入30 μL 的酶混合物 2，轻轻混匀后，放置于MACSmix试管旋转仪上，37 °C 孵育5分钟后，重复22，23步骤。

8. 用胶原酶II分离小鼠心脏的操作步骤

8.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)、

● 红细胞裂解液（130-094-183）

● 细胞过滤网，70 μm筛网

● PEB缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA，4度保存。

● 含Ca2+，Mg2+的HEPES缓冲液

● 胶原酶II溶液：用HBSS液制备含10000U的胶原酶II溶液。（如胶原酶IV C5138,Sigma-Aldrich）

● DNase I溶液：制备含30000U/mL的DNase I溶液

8.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲ 一只小鼠肝脏的重量约为 80–115 mg (Babl/c母鼠, 6-7周龄).

▲ 每C管能够处理一到四个小鼠心脏

1.将小鼠心脏切成2半后，用冷的HBSS液洗涤

2.在C管中加入4.7mLHBSS液， 300uL 胶原酶II和10uL DNase I溶液，制成酶解液，然后将小鼠肝脏转移到gentleMACS C 管中。

▲注：在本操作中必须使用胶原酶II，其它胶原酶不能使用。

3. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

4. 开机，选择合适的分离程序: m_heart_01.

5. 运行 gentleMACS 程序 m_heart_01.

6. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

7. 将C管放置在MACSmix试管旋转仪上，37°C孵育30分钟。

8 反应结束后，将C管倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_heart_02.

10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心，收集管底的细胞标本。

12.重悬细胞，将细胞通过细胞过滤网。细胞滤网放置在50mL试管中。

13.用5mL HBSS液洗涤细胞过滤网

14. 取出细胞过滤网，室温下以300xg离心10分钟后，完全去上清。

15.用1mL PEB缓冲液重悬细胞，加入10mL 1X红细胞裂解液。

16.室温下孵育2分钟。（不能超过2分钟）

17.孵育结束后室温下以300xg离心10分钟后，完全去上清。

18.用1 PEB缓冲液重悬细胞团块，最后用PEB缓冲液调整体积至10mL.

19. 室温下以300xg离心10分钟后，完全去上清。

20.用PEB缓冲液重悬细胞至合适体积，用于后续应用。

9.用胶原酶分离人脐带组织的操作步骤

3.1需要的仪器和试剂

● gentleMACS 分离器

● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)

● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407)

● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。

● I型胶原酶溶液：用PBS配置终浓度为0.12 PZU/ml的I型胶原酶溶液。

● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液

3.2 步骤

▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

1. 将脐带组织剪切成5X5mm大小的组织块，转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入5mL HEPES I型胶原酶溶液。

2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域

3. 开机，选择分离程序: E.

4. 运行 gentleMACS 程序E 1分钟。

5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

6. 37°C孵育4小时。

7. （可省略）在C管中加入12.5-25uL的DNaseI溶液（终浓度为50-100U/mL）

8. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上

9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_spleen_03.

10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管

11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。

12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器，该预分选滤器放置于15mL管子中。

13.用5 mLPBS缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器

14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。

15.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/0e9cd4d14028915f804dc2bf.html