膜片钳之问题汇总

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膜片钳之实验操作篇

1、消化分离海马锥体细胞时，应该通氧气？

不用通氧，直接放入CO2 孵箱里就行了。电极内液应该过滤完分装入EPPENDORF管，用时再拿出来。尽量避免污染。另外，环境中的灰尘也要考虑。细胞外液要及时清洗。

2、全细胞破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。有没有什么办法解决？？？？？

串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。

解决方法：适当增大电极的口径，以利于破膜；电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；灌注电极液的器具也要保持洁净；电极现用现拉；电极下降入细胞外液时给予一定的正压防止此过程中灰尘堵塞电极。

3、破膜以后封接电阻有所降低的话，会不会影响记录到的动作电位？

通常情况下offset调0，是在zero程序下，holding在0，给一个5-10mv，持续2ms的电压刺激，然后用offset补偿电极尖端电位。axon 破膜后电阻当然会下降，根据我的经验瞬时电阻应在100M以上，之后会上升，以稳定在500M以上的为佳，越高越好。

4、第一军医大学高天明教授组分离大鼠海马神经元的方法：

脑片的制备与神经元的急性分离成年Wistar大鼠(200~250 g)麻醉后(水合氯醛40　mg/100 g)迅速断头取脑, 置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2 min, 再用振动切片机(World Precision Instruments MA752-045)切成400 μm厚的脑片。高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L): 蔗糖 234、 KCl 2.5、 Na2HPO4 1、 MgSO4 4、 CaCl2 0.1、 HEPES 15、 葡萄糖 11、 用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3。将切好的脑片置于通以95% O2+5% CO2混合气的EBSS液中孵育1~6 h (室温), 然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中, 并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示, 将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来, 将组织块放入用100% O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(protease XIV, 1.1~1.4 mg/ml)消化30~45 min后取出, 置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次, 用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、 300和150 μm)将之吹打成细胞悬液, 并移数滴至盖玻片上。待细胞贴壁后, 先将盖玻片用浴槽液清洗两遍, 再移至浴槽内进行实验。实验仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。

5、阻断Na通道的TTX浓度应该是多大？500nM

6、细胞的质量是实验的关键,如果细胞的质量不好,你的实验技术再高,结果也不会好的,"巧妇妇难为无米之炊",活性不好可能存在以下几个方面的问题:

a.仔细检查一下配置溶液的水是否干净,我一直用的是去离子水;

b.重新标定一下酸度计,溶液的PH值对细胞的活性的影响是很大的,

c.调整一下消化酶的剂量,消化酶需要根据气候温度等情况不同随时加减

d.消化的时间也是根据具体情况适当的缩短或延长.

e.有时候动物的状态也会影响平滑肌细胞的活性质量的,假如动物挨饿,受冻,受热等使动物处于应急状态,细胞的质量也会下降的.

7、对于血管平滑肌细胞的急性分离，我的体会是：

a.分离液体最好是新配的，超过一周就不要再用了

b. pH应为7.4为宜，宁偏碱不要偏酸

c. 酶量与消化时间、消化温度（一般37℃）要自己多摸摸，不同细胞的条件不同

d. 木瓜蛋白酶的效果比胶原酶好（具体原因我也说不清）

尽管都注意了，但运气还是很重要。

8、封接问题：电极内压是不能给太高的,你想:如果压力太高的话,细胞内液往电极内流的速度不就更快了吗,RUNDOWN不就会更快了吗?你也不能把细胞压的太狠了,那样对细胞也是一个刺激,并且那样更不容易封接了,最好是电极尖端贴到细胞膜后稍微压一点,具体也没有办法说,只能靠自己体会。

9、破膜难：我估计你使用的是国产机器吧,我这里那台国产的机器破膜也是不好,有时候需要用嘴吸,有一次还吸了我一嘴的酚红,恶心了好几天,但是AXON和HEKA公司的两台只要封接好之后,一"zap"却很容易就破了.

10、下压电极是指什么呢？是一入水是的电阻吗？

我们实验室的要求是：一入水时电极的电阻通常在2-5M之间，如果是太小，可能是电极尖折了；如果太大，可能是电极尖被杂质堵了，那就需要更换一个新的电极了。还有一个就是最好使用进口的电极，国产的各种参数不是很好，有时候会影响实验的。

11、以我的经验而言，做血管平滑肌细胞主要有4点：

a. 分离：活性好的血管平滑肌细胞的分离比较困难，上面的帖子大体上说了一些。

b. 封接：由于平滑肌细胞比较小（一般只有20pF左右），封接时，首先应该用灌流液多冲洗几遍，以去除BSA的影响（李慈珍，1994）；其二，电极尖端压细胞时不能太狠，以免刺破细胞，以在高倍镜下看到细胞表面有一小凹陷为宜（这要多练习）；其三，细胞浴液（灌流液）为高渗液体比较容易封接（康华光，2003）。

c. 破膜：分离得到的平滑肌细胞膜都比较脆，所以，1）电极内负压大时，可能还没达到GW封接时细胞已破膜，所以宁可升得慢些；2）zap功能对血管平滑肌而言，太大了细胞容易掉，小了不起作用，具体的参数我认为是没有确定值的，使用时要多次摸索，结合负压吸引，个人的手法，熟练程度和运气都很重要。

d. 电流记录：血管平滑肌细胞钙电流非常小，如脑动脉只有30pA左右，rundown现象又普遍存在，所以我最绝望的就是废了大半天劲却记录不到电流，这一点我还没解决。

12、穿孔模式：我曾经试过，的确是挺难的，首先对细胞的要求是很高的，，从钳制开始经过破膜出现微分电流，到膜片充分穿孔大约需要20-30min，加上给药的10-20min，细胞钳制以后至少要坚持30-40min左右。绝大部分文献是用全细胞模式记录的。

13、平滑肌钙的电流的确是很小的，比心肌的小多了，并且个体的差异是很大的（胃的是这样的），这可能与它的活动特性是有关的。我查阅国内外的一些文献的过程中发现，有2种解决方法：

a、先应用一些药物比如ISO等将钙电流放大，这样就便于观察；b、将钙离子换成钡离子，由于钙通道对钡离子的通透性要比对钙离子的大，钡离子所负载的电流也要比钙离子的大，这样就容易观察了。这两种方法的共同原则就好比是通过一个“放大镜”，可以更清楚的看到钙电流。这样还有一个好处就是减弱了RUNDOWN的现象，但是只要是全细胞就不可避免的存在RUNDOWN，只能将其影响降到最低点，而不能彻底消除。穿孔模式的RUNDOWN影响是最小的，可以忽略。

14、操作：操纵电极进入液面后，在未形成封接之前，不要移出液面。电极进入液面后，电极电流曲线可能超越刻度之外，此时，实验者应降低放大器的增益，直至电流曲线在屏幕上再现，随后要消除电极和浴池电极之间的液结电位。为此，首先将保持电压设置为0mv，并调节“电极失调控制”使电极直流电流接近于零。

封接的成功率与电极尖端入液后的时间成反比。吉欧封接成后，电流波形再次变得平坦，使电极超极化由-40mv到-90mv，有助于加速形成封接。为证实吉欧封接的形成，可以增加放大器的增益，从而可以观察到除脉冲电压的首尾二端出现电容性脉冲尖端电流之外，电流波形仍呈平坦状。

形成高阻封接后，记录实验结果之前，要进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。



数据记录：应恰当的设置放大器的带宽 ，例如10KHZ，这样，在电流监测端将观察不到超越此频带以外的无用信息。



浴池和电极溶液渗透压和PH值的差异将严重影响多类离子电流。细胞的膨胀和收缩可出现某些容积-调整的离子通道电导（Cl-1，K+和其他阳离子通道的变化）。浴液中二价离子具有屏蔽表面膜电荷的作用，因而影响离子通道的电压依赖性。例如钙离子去除会引起Rundown。氯离子在细胞外液和细胞内液中必须含有氯（至少10mM）。以便Ag/Agcl丝实现电子导电和离子导电的接口作用。若溶液和电极充灌液中完全没有氯离子，导电作用将无法实现，除非使用琼脂盐桥。

15、神经元whole-cell patch，主要是海马和脊髓的急性分离以及培养细胞的，海马锥体神经元的大小一般在15微米（直径），培养的细胞可能会更大一点。电极的入水电阻一般要求在3-5MΩ之间，入水前一般要给一个正压以防电极有脏东西堵塞，电极一般压在细胞表面横轴1/3和纵轴1/2交界处（因为细胞表面是球形的，位置不好会影响封接），在接触到细胞后电极继续下压（或斜下压）直至电阻改变0.1-0.2个单位后（如果要做穿孔，个人认为电阻变化1-2个单位比较利于封接和穿孔），松开正压进行负压封接，当电极电阻改变至100MΩ上就可以给holding电压以利于封接。当电极电阻上GΩ后，松开负压，让细胞稳定1-2min，就可以开始吸破了。

16、小细胞的封接应该加大电极电阻的，我们做果蝇细胞时（直径3-5μm)电极入水电阻在6-10MΩ的。同时胞内液比胞外液的渗透压要低一点的，这样细胞洗破后就不会皱缩了。

17、各位中有哪位做过转染细胞，想请教一下转染后的细胞在什么时候做最合适，我查了文献，有的说２４－４８Ｈ，有的４８－７２Ｈ，各位有什么高见呢？另外感觉转染细胞的形态和正常细胞有很大差异，而且细胞膜显得很脆，很容易吸破。

我觉得在２４小时内做基因已经表达，而且细胞状态会好些，可能更容易做成功。

18、各位中有哪位做过转染细胞，想请教一下转染后的细胞在什么时候做最合适，我查了文献，有的说２４－４８Ｈ，有的４８－７２Ｈ，各位有什么高见呢？另外感觉转染细胞的形态和正常细胞有很大差异，而且细胞膜显得很脆，很容易吸破，请各位高手指点迷津，万分感谢！通常情况下我做过电转染的细胞系在48-72H的whole-cell记录,这个时间是根据资料来定的,其实是取决于转染的基因表达产物(蛋白质)的半衰期.

Patch的感觉也是细胞很脆,高阻封接的维持的时间短一半以上.一般是细胞膜光滑些的较好做,可能是那些损伤小,愈合快的细胞吧? 我的办法是多多做些细胞,工作量成倍增加!!

19、动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃.记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。

20、1），为什么绝大多数用急性分离大鼠海马神经元的文献上都是在CA1区做的？是否CA1区好做还是该区意义大？CA3和DG呢？有无这方面的有关大鼠海马各区解剖，生理等神经生物学方面的详细资料？

2），通常切取海马脑片是按照冠状面切取的吗（我一直就是这样切的，是照图谱那样用振动切片机切的）？还是需要先将海马组织块剥出再切（那样不好做）？

海马CA1区神经元对缺血缺氧比较敏感，因此对实验条件的要求也就更严格，而CA3和DG则不太敏感，所以选CA1区的神经元做意义比较大。

急性分离单细胞，用冠状切面切片，其目的也主要是时间更短，速度更快，以保证浅层也有足够多的CA1神经元存活，可以经受后续急性分离损伤。

如果做的是盲插脑片的话，可以将海马组织剥出再切或者横断切片，那样只要保证深层有活性较好的细胞就可以了。

21、负压给的太小,击破以后可能膜确实会融合，但是如果给的太大，有一部分细胞膜就可能被吸进电极尖，将电极给堵了，这是很矛盾的，并且负压的大小还与机器有关，我在使用EPC-10的时候给的负压要比用Aonpatch-1D的要大，有的外文文献上说的是10-20cm压力，我在实际的操作中发现，负压有时候给的很小7-8个cm也可以钳制上去的，这可能与电极和细胞的接触情况有关的，（估计是细胞的表面与电极尖端的截面恰好平行接触，吻合的很好）。另外还有一点是负压不能给的太快了，我的意见是摸索出适合于自己的压力。

22、请问10-20cm的压力到底相当于多大呢？

破膜时负压给的不快，一般开口都很小，记录到电流并不理想呀？

10-20cm的压力指的是10-20cm高的水压，具体的装置可以参见附件里的草图，容器里的液体通常是用带有颜色的,这样便于观察和控制液面。你在破膜的时候是吸的还是用"Zap"？我使用的是"Zap",击破之前给负压使Test seal 达到吉封接阻抗，击破以后通常是不给负压的。另外，“负压给的不快”指的是在封接的时候，而不是在击破以后。

23、10-20cm的水压，转换到针管里大约有多少毫升的气压呀？

我想这个好要看注射器连到Holder上的套管体积的大小。

我只会水压转成水银柱,2-30cm的大管子也不好找zap破膜效果怎么样？Rs能达到多少？我还没见过。我用的是阿axon 200b，都说zap好用,但是我从来没zap成过。

好像说过0.8ms左右的时间，但是我门实验室的200b 0.8在什么位置呀？第一挡是0.5，然后是2、5ms,有用过200b zap 的战友指点一下，好吧？

因为是三通管，注射器里，holder里以及A，C管内的压力是相同的。A管用一根直的玻璃管，上端用一根和玻璃管粗细相近的塑料软管C连接到三通管的一端。用注射器（最好是玻璃的）控制水柱的高度从而控制负压的大小。Zap的效果很好，我们一直就用它。

Axon 200B我没有用过，我用的是HEKA的EPC-10和Axon 的Axonpatch-1D（比较早的型号）有ZAP的，我想Axon 200B是比较新的型号也应该是有的。具体的duration不是固定不变的，如果你钳制好之后用0.5ms击不破你可以增大duration到2ms或者增大它的电压（或电流）的强度。由于机器不同，作的细胞也不同，我的参数也不一定适合你，仅供参考，具体的需要你自己摸索出适合自己的参数。

24、各位同仁，我现在在着手做海马区的全细胞膜片钳，很想分区，主要想做CA1和CA3区，可我不知道怎样去分？？？

我现在也正在做海马神经元全细胞膜片钳记录，主要分离的是CA1区，我的方法是先分离出完整的海马，大概呈“C”型，然后沿着海马的纵轴（长轴）切去外面的部分既是你要的CA1区，具体的你可以先看图谱，然后在分离。

25、求助各位：如果想用银杏业叶提取物的组分来灌流细胞，请问银杏叶提取物用什么配置成溶液？是三蒸水，还是标准细胞外液，还是用DMSO？配置的最后浓度应该是多少？

建议用细胞外液，1-200微摩估计问题不大。银杏叶提取物 具体用什么溶解我没有做过，但是我做的人参和葡萄提取物。大剂量时在三蒸水中的溶解度很低，先溶于乙醇家水还会析出大量结晶。如果你要做灌流的话，即使先用DMSO溶解，再用外液稀释，只能得到混悬

液（用前要充分混匀），并且需要加做对照组。如果 jixincai 需要的剂量不是很大，还是用细胞外液溶解灌流简便、实用。

26、请问哪位是做豚鼠心肌细胞急性分离的，我想问一下是用什么酶，消化多少分钟得到的心肌细胞状态比较好 ？？

我们做大鼠心肌细胞急性分离。30ml台氏液（0.06钙）加20mg一型胶原酶，3mg蛋白酶，20mg牛血清白蛋白。至于消化时间要根据老鼠大小，和灌流速度来定，没有固定的时间。我们的做法是，在心脏膨大变软后，从心室内吸少量液体在显微镜下找单个心肌细胞，见单个细胞后再延长半分钟到一分钟。



消化时间要自己摸一下。酶的量也不一定，我记得原来做的时候，20ml液体用了5mg一型胶原酶,3mg蛋白酶。我个人觉得酶还是要用Sigma的。



需要根据你实验室的酶的纯度活性，重新定量，个个实验室是不同的。 我们用的2型胶原酶 8mg，不过是粗酶。消化时间也受很多因素影响，没毒浓度、温度、豚鼠状态、个人习惯都影响很大，需要即时观察，到豚鼠心肌消化变大变软变色、酶成浑浊，方可剪下。



分出来的细胞复钙后，存活50%左右，比较好用。还有在吸取心室内液体前，应稍微挤压心脏，使单个心肌细胞易于脱落找见。

27、首先谢谢你,我看有的文献就是先用DMSO 溶解的,,然后用外液稀释,用做灌流怎么会只能得到混悬液呢?我现在查到大概可以用DMSO ,标准细胞外液,还有用丙二醇还溶解的,我想知道哪个能够溶解微米制剂的银杏叶提取物效果更好呢?

DMSO促溶的原理是将药物分子包裹，然后溶于水溶液，所以，在药物分子外存在DMSO包膜，并不是直接将药物分子溶解于水溶液中。我曾经用DMSO溶过人参皂苷，可以看到颗粒悬浮。

28、我最近在用离体灌流的方法急性分离大鼠心肌细胞，但是分离到的细胞非常少，而且都是死细胞。我先是用有钙台氏液灌流5min，再用无钙台氏液灌流5min，然后用消化液灌流（含胶原酶II0.6mg/ml),灌流到流出液变浑浊为止,然后在该消化液中剪碎吹打后离心1分钟(1000转),我消化时间从5min到20min都尝试了,但所得细胞非常少,而且全是团状死的或正在死亡的.请问哪位高人可以给予指点迷津,在下不甚感激,另外以什么标准来衡量心肌消化好了.(我用的是三蒸水,灌流液温度37度)

你说分离的细胞非常少，对此，我不是很理解。如果按以下分析，应该细胞数很多，并且死细胞占大多数。

根据你的实验方法来看，又几点不太合适，建议进行一些调整。

1）.“有钙台氏液灌流5min” 时间过长，通常加入有钙液后，只要心肌复跳，即可停止，改用无钙台式液冲洗。

2）. “无钙台氏液灌流5min” 无钙台式液应冲洗至心肌停跳 ，时间长短要看具体情况而定。有钙液一定要冲洗干净，否则，加酶后很难分下活细胞。

3）.“消化液灌流（含胶原酶II0.6mg/ml)” 0.6的浓度过高，建议在0.2附近调整，以找到实验室适合的浓度。

4）.在我们实验室是不进行离心的，细胞状态不错。但必须将酶液冲洗干净！

5）.剪取心肌的时间，大部分来自于经验，由于，细胞消化时间并不一致，应该分时间，分不剪取。

总之，各个实验室的条件不同（包括仪器和室温），具体方法只能自己摸索，祝你实验顺利、成功。



我做过急性分离的海马细胞whole-cell记录，遇到你说的这种情况，应该属于酶消化过了，你可以减少酶的量或缩短消化时间看看。一般我消化细胞的步骤是：切出的脑片在培养液中孵育至少30min，用酶消化（时间），吹打出细胞，静置20min，然后就可以实验了。好的时候做5-6小时没问题的！

Whole-cell的步骤：上电极，给正压，找到细胞，下电极至细胞纵轴的1/2与横轴1/3交界处，当封接电阻变化0.1后，松开正压，给与负压吸引，直至电阻到达G欧，松开负压，让细胞平衡1min，继续负压吸引直至吸破，就OK啦！

试一下以下措施:

1.不要用有钙台氏液灌流5min。直接用无钙也灌注，时间要足够长，使得细胞内的钙离子完全排出。

2.取出的心脏可以放在冷的正常1.8钙台氏液中。

3.酶液的时间以心脏的颜色和硬度来确定的。也可以不断观察流出液体中是否有心肌细胞，来确定时间。

4.酶灌完后，一定要用台氏液好好冲洗，至少50ml液体。“该消化液中剪碎吹打后离心”，坚决不能这样。

5.刚分下来的细胞成活率约为90%以上。

我曾经试过做穿孔patch clamp，用的nystatin sigma N4014，但最终放弃。原因一，nystatin sigma N4014溶解度小，要用二甲亚酚溶解，另要用超声波振荡机助溶，之后还要过滤；二是要避光；三是穿孔的成功率低。若真要做的话，诸多条件须摸索。

29、J Neurophysiol. 2000 Feb;83(2):955-62. 这篇文章记录的是EPSCs，怎么用的电极内液是用来记录IPSC的呢？

我没看这篇文章，但记录EPSCs和IPSCs，是可以通过改变钳制电位或给与不同的拮抗剂（例如用Glutamate的抑制剂来记录IPSCs）来实现的。

30、你好！我也是作血管平滑肌细胞离子通道的，下一步打算作单通道，有几个问题向你请教。

1）、我们实验室的放大器为***光电的CEZ-2300（抗干扰性比Axon差），可否作出钙与钾的单通道电流？（我的软件为Axon Clampex8.0；分析软件为Clamfit 8.0）

2）、细胞贴附式记录的操作步骤与全细胞记录是否基本相同（包括连线）？protocol的设置应该没有特殊要求吧？

3）、单通道电流分析时，其电导、电流-电压图与直方图都是用clampfit得出来的吗？

你以前作的什么类型单通道记录，有无比较好的参考文献？

1）、我想CEZ应该也行的，做单通道关键是噪声要足够得小，因为Ca2＋channel的电导很小，所以要求噪声更小才行；

2）、实验的方法上和全细胞还是有差别的：根据我的经验，电极电阻一般在7－11M左右较好，若通道密度小电阻可能还要小一些，封接过程与全细胞差不多，gain一般在20－50倍，滤波在2kh以下，采样时间我采用10秒，阶梯去极化，溶液配方根据你做不同的通道也和全细胞不同，这个要参考相关文献；

3）、clampfit我没有用过，我以前是用HEKA放大器，单通道分析是TAC，TACFit专用软件，我想你可以去AXON网站看看clampfit的功能。

我以前是做BKCa通道的，因为电导很大，所以较容易做，若你做这个通道可以提供一些文献，钙通道我没有做过，不过要求噪声很小才行。

31、我现在遇到的问题是用消化酶灌流4min(0.5mg/ml)心脏后心脏局部就变白,8min左右整个心脏就变白,不知道是什么原？

可能原因：1）、冠脉中有微血栓形成，导致灌流不均匀而致。处死动物之前，先腹腔注射肝素1000u/kg.2）、大鼠的状态也是非常重要的。

32、我做钙通道的经验，一是将噪音降至fA级，因为钙通道的电导就是25pS左右；二是在电极液中用BaCl2来替代钙。

33、我做心肌膜片前已经好长时间了，一般是在下电极之前，先将于槽内冲洗干净，下电极尽量下在视野中心，减少电极的移动，降低堵塞的机会，效果还可以。但是经常见战友说，在电极入液前给一正压，我一直不理解是怎样做到的。我们实验室的负压系统是用2ML注射器给的，是在下压电极的同时用针管给一正压么？能否具体说明一下。非常感谢各位！

我们实验室常采用口吹连接电极的注射器给它正压的方法，下电极时要边吹边把电极送进细胞外液。当电极到达细胞表面时，停止吹气，轻轻地吸注射器口给予负压，达到封接的目的。

根据我个人的经验，下电极的时候给正压反而容易把电极堵了，估计是因为加正压后电极尖部的液体流动，导致杂质更容易粘附到上面，而如果不加压力，液体基本是静止的，杂志黏附上的几率反倒小。

34、我是作脑动脉血管平滑肌细胞钙电流的，做了很长时间但效果不是很好，上面战友也有作平滑肌细胞的，真有同命相连的感觉。我们可以互相交流，共同解决问题。

对于血管平滑肌细胞的急性分离，我的体会是

1）. 分离液体最好是新配的，超过一周就不要再用了

2）. pH应为7.4为宜，宁偏碱不要偏酸

3）. 酶量与消化时间、消化温度（一般37℃）要自己多摸摸，不同细胞的条件不同

4）. 木瓜蛋白酶的效果比胶原酶好（具体原因我也说不清）

尽管都注意了，但运气还是很重要。

国外的消化方法大都两步或三步法，郑永芳教授实验室用两步法消化，但我用他们的方法效果不是特别好，可能各个实验室也有差别。

35、我正在做大鼠心肌细胞膜片钳，感觉每次细胞分的都不错，可是在复钙时，细胞就多数收缩死亡，这主要是什么原因，还有在记录电流时，是否必须要灌流，不灌流行吗，另外，细胞似乎很难贴壁，我也试过多聚赖氨酸，效果不是很好，可能是使用不当的原因吗？（是不是，先涂上多聚赖氨酸，等到晾干后再滴细胞悬液）

我觉得如果你不用新的培养皿，那你一定要彻底清洗培养皿（首先要泡酸），然后涂上多聚赖氨酸，在室温放置自然晾干，或是用干烤箱烤干（55-65度）然后在滴上细胞悬液，那样细胞贴壁较牢固。

36、你好，我也是做血管平滑肌细胞的，现在我想做全细胞钙电流，请问你用的细胞外液Ba2＋是多少？能否告诉我你的电极液和细胞外液的配方？

灌流液的组成为（mmol/L）: Tris-Cl 75，BaCl2 50，Hepes 10，glucose 10;通以95% O2+5% CO2后用0.8 mol/L 的Tris调节pH值到7.3。电极内液的组成为（mmol/L）：CsCl 150.0，MgCl2 3.0，EGTA 10.0，HEPES 10.0，Na2ATP 3.0;用CsOH调节pH值到7.3。BaCl2 、CsOH与CsCl均购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯试剂。该配方做大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞是没有问题的。

37、我的课题需要做inside-out单通道，但我们这儿只能做全细胞，请问您知道国内哪儿做这种吗？还有您能推荐一本关于膜片钳的好书吗？我只有一本陈军的，关于inside-out讲的很少，请您多指点。inside-out怎么保证是单通道呢？难道钳下来的小膜片上不能有2个或2个以上通道呢？

我也没有做过单通道的。不过关于封接了几个通道的情况呢，谁也不能保证里面封住了几个，有可能0，也可能是3-4个，到时候要根据通道的大致电导估计。



假设一个通道电流是i,如果是两个通道，则电流可能出现1i,2i 两种情况（因为有时候只有其中一个通道开放），不可能有中间量，如果封接了3个，则有1i,2i,3i三种情况。这样根据电流的分布情况，就能判断里面是几个通道了。

只要电极口径合适，一般不会封接住太多，如果太多就无法判断电流了，或者说封住太多说明你的电极不合格。

38、我是做DRG细胞的钠电流的，但最近不知为何记录不出TTX-S电流（也就是说加入TTX1μM后电流没有变化），已排除没有给上药的原因。

我是用的酶解细胞（胰蛋白酶和胶原酶），外液用的是正常外液，TEA、4－AP等阻断剂以及TTX是通过Y管临时给药的。

除了TTX失效的原因，还又什么可能性啊？与酶解有关吗？

细胞封接如何啊？如果细胞封接不好，也会影响电流的记录。酶解的时间和温度把握好，如果这两点都可以排除的话，尝试着加大TTX的用量。

39、我想测定原代神经元的钾通道电流， 请问是否所有的钾通道电流的电极内液和细胞外液都是相同的？ 能否提供个配方？

不同细胞因为所处环境以及通道分布的差异,记录钾电流时的内外液会有一些不同,但大体上是类似的,具体要参照相关文献。

我们实验室做海马神经元IA和IK时用的内外液如下：

细胞外液：（mmol/l）NaCl 144,KCl 4.0,CaCl2 1.8,MgCl2 0.53,Na2HPO4 0.33,

HEPES 5, Glucose 5.5, 用NaOH调PH值为7.3。细胞外液加入TTX 1 umol/l阻滞钠通道，CdCl2 0.2mmol/l阻滞钙通道。

电极内液：KCl 130, Na2ATP 5.0, creatine phosphate 5.0, HEPES 5.0,用KOH调PH至7.4。

40、灌流液的组成为（mmol/L）: Tris-Cl 75，BaCl2 50，Hepes 10，glucose 10;通以95% O2+5% CO2后用0.8 mol/L 的Tris调节pH值到7.3。电极内液的组成为（mmol/L）：CsCl 150.0，MgCl2 3.0，EGTA 10.0，HEPES 10.0，Na2ATP 3.0;用CsOH调节pH值到7.3。BaCl2 、CsOH与CsCl均购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯试剂。

该配方做大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞是没有问题的。

我用了你给我的这个配方在做急性分离的血管平滑肌细胞时失败了2次,还要你多给一些指点,谢谢!

1,全细胞记录不到Ca2+电流,好像还是K+电流,都是正向电流;

2,细胞在这个灌流液里很快就死掉了;

3,电极若给正压,入水后尖端很容易出现结晶.

您做实验时遇到这些问题吗?

第一个问题：全细胞记录不到Ca2+电流,好像还是K+电流,都是正向电流

解决方法：

1、Ca的通道电流很小，所以封接时电阻稍高些（2G）；可避免封接漏电流的产生；

2、Carundown明显，所以破膜后立即记录，可把protocal的刺激间隔时间设为最小，快速记录；

第二个问题：细胞在这个灌流液里很快就死掉了;

细胞外液中如果无Ca，细胞可存活很长时间；你的问题可能有两个原因，1、你的外液中是否搀杂钙离子；2、你消化细胞的状态不好。

第三个问题：电极若给正压,入水后尖端很容易出现结晶.

由于外液中钡为50，容易与内液中的ATP结合形成沉淀，我的作法是，先在钡为10的外液中进行封接，封接完成后，换50钡外液破膜，记录，效果不错。

当然，主要问题还是钙电流太小与rundown问题的解决，多多摸索适合自己的方法。



膜片钳之实验操作篇.doc (260.0k)

膜片钳之实验操作篇



41、在细胞外液中用Ba2+来代替Ca2+，目的是为了避免Ca2+升高加速钙通道得衰减，而且大多数的钙通道亚型对Ba2+的通透性要大于Ca2+，用Ba电流替代钙电流可将电信号适当放大，便于分析通道的特性。

谢谢你哦，这个我知道啊，我只是不太清楚用钡引出来的电流与钙有什么区别，对钙通道有什么影响，因为看过一篇英文文章上说钡对LVA的影响和HVA的不同，但并没有说究竟是什么不同，他没说，我就是想知道这个。

1。钡代替钙离子，细胞内当然最后也都是钡离子了，而钙离子会变的很少。因为发生了钡内流。

2。由于细胞内的钙离子可以加速钙通道的失活，而钡离子却没有该作用，因此用钡离子做出来的通道电流失活较慢，就是通道关闭速率慢，表现在I-V曲线上就是电流达到峰值后上升的比较平坦，而如果用的是钙，会很陡峭上升。不知道你明白了没有。

3。至于电极尖上的结晶，我的做法是：从来不给正压。因为我觉得给正压后液体流动加速，液体中一些絮状杂质容易沾在电极尖端。本来给正压是为了防止电极被堵，现在给正压后反倒容易堵，所以干脆别用正压好。不知道是发明的用正压的方法。我反正从来不用。

42、请问怎样才能提高全细胞高阻封接的形成,另外电极与液面的夹角几度最合适？

我也刚开始做膜片钳.就我所知道的.1.电极一定要好,如果是国内一般的电极买回来要用甲醇泡一下,然后用酒精灯烧下,目的为了使电极内部干净.2.技术方面:下压时在细胞的1/3处,电极与液面夹角为45度左右.3.当然细胞状态好是最关键的.这就看你消化用的酶或者是分离方法和步骤了.

43、关于钙rundown的问题，可以试着摸索一下在您自己的实验条件下，钙电流相对稳定的时间段，比方说如果您的钙电流峰值在破膜后10-20分钟，变化不超过10%，这样基本就认为他稳定了，而且如果您的药物作用大大超过10%的话。

44、我做膜片钳的一点经验（在海马细胞上）

我是搞电生理专业的，做了2年膜片钳，做的是急性分离海马细胞，是全细胞膜片钳，和大家分享我的一点心得，也回答一下战友们在前面提出的问题。

膜片钳其实不难，它只是一种方法，大家如果只是用它做课题的话，个人认为没必要去深究它的电学原理，只要知道个大概就可以了，重要的是要知道膜片钳能够做怎么，能够应用在哪些方面。目前就我所知药理，电生理，心血管，麻醉，耳鼻喉都有人在做膜片钳。

细胞的制备，有人说膜片钳技术80%的工夫在做细胞，深以为然。我做的是海马细胞的急性分离，做过机械分离也做过酶解。方法文献上都有，我就只谈谈一些细节把，分离切片在0-4度氧饱和ASCF下分离，温度应该尽可能低，包括分离海马的器械最好也在冰箱里冻过，也有人手工切片。分离鼠脑应尽可能快，且不要压挤鼠脑，因为鼠脑对缺氧和压挤特别敏感，尤其CA1区。压挤后细胞状态往往不好。切片好后在32度孵育30分钟，这个很重要，同时通氧气。30分钟后分离出海马酶解。酶量看各个实验室我采用的是1MG/6ML 消化20分钟后吹打，酶解的时候也要通氧，以气泡不搅动液体为标准。

接着的机械吹打要注意，吹打的滴管管口应烧灼过，以减少吹打对细胞的应力损伤，要注意的是在滴管管口和不要和试管底接触时吹打细胞，那样对细胞损伤很大。

细胞贴壁后就可以做膜片钳了，要注意的是电极内液一定要过滤，加入电极后一定要看看电极尖端没有气泡。电极内液不要加太多，1/3，淹过银丝就可以了。电极入水前要给一定正压，可以防止电极尖端被杂质挡住。电极下降到细胞上端稍上方再微调细胞与电极的接触面。个人认为不应在细胞正上方下降与细胞接触，大家想象一下 一个管子怎样才能和一个球体接触的比较好呢，显然是管的直径和球心对齐，当电极按一定角度与细胞接触时，显然最好的接触点不在细胞正上方，我比较喜欢电极45度入水，接触点在细胞正中和最右的中间。尤其是封接海马细胞这样的小细胞接触点更重要。封接后就是吸破了，有战友问海马细胞太小，不好封接。个人认为电极的尖端开口是一方面，封接技术也是一方面。吸破是里面最难的一步。由于海马细胞小，很容易就把细胞吸到电极里了。因此要非常小心，我做膜片钳是用嘴吸的，一般封接平后，先等一下，有时会自己破膜。如果不破再吸，缓慢加负压，一般加一下我就松一下，否则负压太高即使破膜也会把细胞内容物吸到电极里。

有战友问破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了，我也碰到过，我一般是再轻轻吸一次，有时会恢复的，再不行放大器上还有一个按钮是给细胞一定电击的，可以通过它破膜的，但不推荐使用，电击破膜，细胞状态往往不好。

我主要做的是全细胞膜片钳，做配体门控的，电压的没做过，但是我知道做电压门控的一定要记得补偿，不然做的东西就没一点意义了。

关于干扰的问题，我认为一定要屏蔽，接地最好有单独的地线，实验室内减少不必要的无关电器。

45、我也是做急性分离海马细胞，也是全细胞膜片钳，而且还是做配体门控的。我想向您请教一下：

1） 您在做海马神经元急性分离时，是最后把细胞放在ASCF中，我想询问一下，你急性分离的细胞 最多能够维持几个小时？您做过把分离好的细胞放在标准细胞外液，然后再进行PATCH吗？用标准细胞外液和ASCF有什么区别吗？

2）您是怎么加入药品的，加药管口径是多大，距离细胞有多远，还想请问一下，您做的是什么，您是单纯通过文献来确定给药的浓度的吗？

在最后做膜片钳的时候是在细胞外液中做的，我做的细胞最好的能坚持一个小时，在过就不行了。在实验开始是用ACSF 消化也是，终止酶消化也是ACSF。到吹打细胞就是标准细胞外液了。。给药系通过快速换液装置的排管进行，（我们科室自己制作的）每管内径0.2mm，管口距所记录的细胞约100μm。加药后即切换至细胞外液灌流管，实验在室温22-25℃范围内进行。

我做的是单纯的机械分离海马细胞（你可能没那个条件做），但酶消化也做过的，关键是把握消化的程度 和取老鼠海马的时间和温度。我的给药浓度是10-3E~10-5E 是根据我们科室在外周三叉神经节上做的浓度 为了对比 就采用一样的浓度。你也可以根据文献来确定 开始加的浓度，以后在根据实验中的结果改。

46、有同事做CA1细胞，细胞状态看起来还不错，但是封接很容易就是破膜破不了，我也尝试破过几次，感觉阻力特别大，又不敢给太大吸引，电击穿也没有成功。电极电阻在6-8M左右，有文献做过10M的呀。一般破膜时，细胞都掉了，也没见被吸进电极。是否可以降低电阻试一下。请问各位的经验怎样？还有什么原因，造成破膜不成功。

一般封接平后，先等一下，有时会自己破膜。如果不破再吸，缓慢加负压，一般吸一下我就松一下，可以慢慢加压力，反复几次一般细胞会破的。也可以降低电阻试一下，看看是不是降了电阻后会好一些。

就我现在知道的，电极电阻和内液关系很大，我前一阵子还不知道这回事。我测了电极内液渗透压才170多，这样每次电极虽然拉的挺好，但入水后总有5M多，我实验室做别的的师姐用我这内液也如此，虽然好封接，但对实验结果影响很大。后来我师姐换了配方，她现在每次电极入水都3M多。从这件事看出内液对电极电阻的影响比它本身拉的好坏影响更大。你最好也测测内液渗透压，接近300才是正常的。你看文献上的也只能做参考。可能好多因素影响了你所观察到的电极阻抗。

47、一般要等多长时间呢？我通常等到电阻到达3-5g左右，即行破膜，而且，我做心肌的经验是如此反复抽吸，将细胞吸掉的可能很大（仅就心肌而言），可能由于破坏稳定封接的离子平衡造成。不知CA1与心肌比较，是否是膜相对薄一些？hateggyy兄所在实验室，有用电击穿破膜的么？



请问测渗透压，一定要用渗透压仪么？

反复抽吸是说破膜前 为了不给细胞膜太大压力免得吸破后细胞内容物被吸进电极。如果膜都没破怎么会破坏离子平衡呢。我说的反复抽吸不是吸一下再把压力完全松下来，其实你的负压应该是缓慢升高的，这样才能最后破膜。就是说总的趋势是缓慢升高负压。

我没做过心肌细胞 ，但是好象比海马好做些，我同学有不少做心肌的，但做海马的少。

电击破膜是可以的，但是个人经验电击后破膜的细胞状态往往不好，坚持不了太长时间，所以尽量吸破。

应该是,我这里也测不了,还是我师兄他们去 科大 顺便帮我测的,他们的内液也有点小问题,但相差没那么远就是.而我的差的太远了.所以我的电阻在同一台机子上和他们相差比较远.而我们的电极拉制是差别不大的.测渗透压的仪器我问了他们,他们也说不上名称,反正是专门用来测渗透压的.仪器很小.还有就是尽量吸破,电击的细胞破了也不会很好.

48、电极老是堵有三个原因。1.电极没有经过泡酸和去脂处理。2.电极内液没过滤。3.细胞要灌流。

49、overload 主要原因是测定的电流值过大，电流峰值超出标尺最大值。

可能由于1）.入液后出现overload，可能是offset为校正，电流值超出，2）.地线连接问题，噪声过大，3）.断电极，电流超载，可能，还有其他原因，暂时还没有总结全面，建议重连地线（刚学的），也许有收获。

50、我做原代培养的海马和皮层的全细胞膜片钳实验，在吸破时总出现问题，破膜后封接电阻就只能到200-400M，而且记录到的电流也达不到1000PA，我身边有人说是因为细胞破膜不完全，我不明白，怎么会不完全呢？

再就是内液和外液必须测渗透压吗？我在哈尔滨，没条件测定呀！

各位在这个问题上都怎么处理的？

A. 对第一个问题，封接电阻反映封接是否良好（只有200到400兆，漏电流可能比较大），这一点可以从你的holding current显示出来，漏电大的话，holding current就会很大。

B. 破膜是否完全，则是从Ra（串联电阻）显示出来的，一般说来，Ra应该控制在30兆以下，有些比较严格的实验室甚至是控制在20兆以下。Ra大的话，记录到的电流就会很小。

C. 内外液的渗透压，最好是测一下；如果实在是没有条件，可以采取几种方法：

1. 选择文献上已有的给出渗透压的配方；

2. 如果是自己的配方，可以通过离子浓度进行估算，比如NaCl解离成2个离子，估计为1mMNaCl折合2mOsM（这个只能是估算，误差比较大，有时候误差可能达到30mOsM）；

3. 事实上，测一下渗透压，也可以检测一下溶液配制是否足够准确，并且出了问题后有利于排查。

B. 破膜是否完全，则是从Ra（串联电阻）显示出来的，一般说来，Ra应该控制在30兆以下，有些比较严格的实验室甚至是控制在20兆以下。Ra大的话，记录到的电流就会很小。

我们是10m。

51、你好,可以请问一下你的灌流液中Tris-Cl 75具体称量方法吗？我有点搞不懂 ,我买的是Tris碱，是固体，可是Tris-Cl 是液体，试验中要称取5.909克该怎样做呢？我做的也是平滑肌细胞，分离了2次失败了，可以共同探讨一下吗？

不好意思，几天没上网了。你将所有试剂都称量好以后（其中包括Tris碱（固体）），加水稍微溶解，用浓HCl调节PH到7.4即可。

1）、我是从来不加正压的，

2）、Tris-Cl 你显然买错了，你买的盐，而应该买Tris碱，配成液体才可以用来调节pH。

52、请问做（消化道）平滑肌细胞的高手，我在封接后总是不能破膜形成全细胞模式，用负压或zap,似乎都不太理想,还是与封接的手法有关？

我一直在做胃的平滑肌细胞，关于你提到的封接而不容易击破，难以形成全细胞模式的问题我也遇到过，可能存在以下原因

1）、分离的细胞状态不好，特别是细胞膜表面不干净，有许多颗粒，钳制后，那些颗粒可能正好堵在电极尖的口上，虽然封接的很好，达到好几个G以上，但是用ZAP以后有颗粒的阻挡，所以就很难将膜击破，

2）、不知你给的负压是否是太大了，这也可能是一个原因。如果给的负压太大的话，就可能将细胞膜吸入到电极尖内，将电极尖给堵上了，这样也不容易击破

3）、你可以将ZAP的幅度和duration适当的调的稍大一点，或形成G封接以后稳定一段时间再击破。

53、请问各位高手有没有做表达离子通道的?国内有没有哪些单位用HEK293或Xenopus oocytes表达通道的？用HEK293表达难不难呀？

很容易的，用磷酸钙转染就可以达到20%以上，而且用来做patch也很容易的，半天就可以出一组数据了。祝实验成功！

to dear zlhustc ,

今天按照说明书测试了一遍.所有的结果和书上的一样.就是用MODEL CELL 测试时测试PATCH的理论值应该是10G欧,而我只能到8G欧,这是正常现象吗.

仪器测试完毕,就可以开始用真细胞做了,用什么细胞开始比较好呢?可以直接用我课题需要的细胞做比较好吧.

54、我用脂质体转染，效果不好，20%左右。而且细胞封接起来，非常困难（细胞膜状态不好，有好多颗粒）大一点的细胞，膜又太韧，不能破膜。请问，可以从那些方面入手调整细胞状态？另外，温度控制很难，细胞很快就脱壁，请问你的实验室是怎么控温的？膜片钳是什么型号的？

脂质体转染是会影响细胞状态的，所以要做patch，还是用磷酸钙或电转比较好，而电转那么贵当然是磷酸钙啦！

1）. 改善细胞状态: 主要是你培养的细胞在转染前的状态就要好，细胞密度不能太密，大概30-50%，一定要贴壁好；传代30次后的细胞就不要用了，可能会有细胞性质的变化；转然后的细胞只能用24-48小时，就不能用了，我一般在转染10小时就开始用了；还用就是你的转染质粒是否太大了，你一般什么时候洗脱质粒啊，我是在8小时左右洗，你的质粒如果太大就要适当缩短时间，一定要洗干净，不然也会影响细胞状态的；另外用HEK293T细胞可以大大提高你的转染效率。

2）. 我好像没遇到过细胞脱壁的现象，会不会是你的多赖不好啊。记录所用的细胞外液一般在记录前要恢复到室温（25度）并通氧半小时以上的；

3）.Axon 200B/Axon 700A

55、因为我一次都没有做过，所以心里没底，能否告诉我在哪里可以学习一下吗？我老板会支持我的，不知道您是否有Protocol，能否具体指导一下？

1）.制备磷酸钙DNA复合物 2mM CaCl2 9.3 微升 质粒 3 微克（可视具体情况适当调整）

用水补足至75 微升，混匀 再加入75 微升2xHBS，混匀（一定要混匀），总体积为150 微升，避光30分钟；

2）. 吸去HEK293细胞dish中的原培养液，用PBS洗一次，然后加入新的培养液；

3）. 将磷酸钙DNA复合物加入到载玻片上，轻轻晃动，混匀，置入CO2孵育箱中培养；

4）. 8小时后用PBS洗3次，然后加入新的培养液，继续培养，24小时后就可以记录电流了。

56、用什么方法可测膜电容？

我用的是HEKA的EPC10在操作界面上直接就可以显示膜电容，用的AXOPATCH的可以通过补偿得到相应的膜电容。

57、我做海马和皮层的全细胞膜片钳实验，在吸破后阻值下降很多，有时都达不到300M，各位高手在做海马和皮层细胞时，吸破后阻值都能达到多少，多大的阻值可以记录啊？



我做海马全细胞膜片钳，好的细胞吸破后阻值一般大于500M，达不到300M可能是吸过了或吸太快了，或细胞状态不是太好。一般吸破后阻值大于500M的记录的补偿的比较好，电流比较稳定。

58、如何测静息膜电位呀! AXON200B PCLAMP8.O

哪里能接受外来人员的参观学习呢?还想请教个问题,你选用的细胞外液和电极液是什么.

我现在用的是军科院的配方,可感觉记不到电流,不知什么原因.另外怎么判断细胞吸破与否,判断的标准是什么.

我用的标准细胞外液（mM）： NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，D-Glucose 10，NaOH调节pH7.4；电极内液（mM）：KCl 140，CaCl2 2， MgCl2 1，HEPES 10，EGTA 10，MgATP 2，KOH调节pH7.4

封到GΩ后补偿快电容，看到的图基本是条直线，然后开始吸破，吸破后会出现上下两个峰很明显，然后补偿慢电容和漏电流，再记录电流。我用注射器吸的，吸一点等一会，然后再吸，不能一次吸太多太快，阻值开始有点下降的时候要注意，一般要破膜了。破膜后等一分钟左右，可以把负压放掉，这样阻值会回升一些再补偿，等稳定后记录电流。

将MODE调节至I-CLAMP，METER调至Vm,此时的METER值即为静息膜电位。

59、本人是个新手,刚开始做急性分离心肌细胞全细胞膜片钳(AXON200 ,我的问题是电极入液后基线漂移非常大,offset也不能将其调回零位.为什么?

我没有做心肌细胞，不过膜片钳的原理都是相通的。

你的问题可以认为是基线漂移的问题。

产生基线漂移的可能因素：

1。电极内外液的液接电位差大

这个可以通过clampex自带的公式进行计算，把内外液的离子种类和摩尔数输进去即可。

2。AgCl镀得不好造成的电极极化

为了排除这一点，重新镀一下电极丝跟地线吧。

3。整个回路中有其他金属和溶液导通形成原电池

如果新镀的电极丝，特别是地线，没两天就变白了，那么，仔细找找看，可能什么地方跟溶液导通行程原电池了，不停的充放电，基线不漂移才怪！

4。最后一种可能就是，你的protocol设置里头加了holding。

60、再请教一个问题,是有关液体配方的,我查了许多资料,发现台氏液、灌流液、电极内液、酶液等的配方都不尽相同，有没有一个比较标准的？再有就是酶液消化后是否一定用KB液冲洗，用无钙台氏液行吗？我做急性分离心肌细胞全细胞膜片钳(AXON200B）

酶消化后可以用KB冲洗，也可以用不含酶的酶液冲洗，也可以不冲洗，总之，这要自己摸索出适合本实验室的条件，只要能分离出合适细胞就可以了。

膜片钳要求的细胞状态要很好，好的细胞在视野中饱满、周围有亮的光晕，与周围的界限很清楚。

每做完一个细胞，必须换一根电极，即使电极没断，因为上一个细胞的胞膜很可能帖附在电极上，使尖端有干扰。

不是所有的内液均要加ATP的，跟你记录的电流有关，ATP的作用主要是使电流的rundown现象尽可能的减小。

61、不要着急。作实验本身就是一件折磨人的事，尤其是作膜片钳。相当初，不怕你笑话，摸了三个月才记出电流来（因为没有人指导）。

1.一般来说，心肌细胞体积较大，电极电阻2-5M为宜。

2.从折光性上来判断细胞的状态，这需要多练，作几天你就会看了。

3.高阻封接的影响因素很多，例如：细胞外液干净与否（急性分离的细胞含杂质和死细胞较多），电极的尖端是否抛光，细胞消化的时间和消化酶的种类是否合适等等。需要一项一项排除。

电极电阻8m太大了，不容易破膜。心肌细胞的折光性和横纹，以及细胞完整性是筛选细胞的部分标准，还有个人爱好（这很关键）。膜干净、状态好，电极清洁平整，高阻封接很容易形成。

我说的个人爱好，和你做实验的手感以及负压系统有关，好比有人喜欢做膜脆一些的、有人喜欢韧一些的，关键看是否能获得的高阻封接的状态。

对于不能形成高阻封接，我个人经验是最重要的还是细胞膜是否干净，细胞贴壁后多冲洗一会，对您形成高阻封接会有很大帮助。电极电阻2-4M，电极越细高阻封接越容易。

62、如何测定渗透压？用什么调节渗透压？

渗透压可以由渗透压仪来测定，也可以根据离子浓度自己计算，但这很麻烦也不精确。好的膜片钳实验室一般都要配渗透压仪。一般用蔗糖等来调节渗透压。

63、本人实验采用的分离大鼠动脉平滑肌细胞的改进方法

本实验室参照国外文献中的分离方法，本着经济实用的原则，使用一种价格十分低廉的粗制木瓜蛋白酶，经过数十次摸索，成功地分离出大鼠动脉VSMCs。我们分离得到的VSMCs外观舒展，活性好，在去甲肾上腺素作用下具有收缩活性。细胞能耐生理浓度的钙，容易封接和破膜。并且使用该方法分离得到的VSMCs成功记录出K+通道电流和Ca2+通道电流。

分离用液体：。将新分离出的大鼠小动脉（隐动脉、腹主动脉、颈内动脉、大脑基底动脉、肠系膜动脉等）转移到一个装有5 ml 4 ℃的生理盐溶液的培养皿中，液体中加入30 µM硝普钠。在解剖显微镜下，小心地去除血管外结缔组织。将小动脉剪成0.5 mm左右长的小段。小心地移走培养皿中的液体，换入5 ml洁净的室温的分离溶液（加入1 mg/ml BSA及30 µM硝普钠的生理盐溶液），室温下（20~25 ℃）平衡10 min。然后移去培养皿中的分离溶液。将新称出的5 mg木瓜蛋白酶（papain，BIB，德国）和3 mg二硫代苏糖醇（DTT，Amresco，美国）放入洁净的试管中，再加入1 ml分离溶液，轻轻摇晃后放入37 ℃水浴中使酶溶解。随后用吸管小心地将动脉段转移到装有酶液的试管中。将试管放入37 ℃的水浴中温育。温浴的时间分别是：腹主动脉，35 min；隐动脉，35 min；颈总动脉，33 min；肠系膜小动脉，25 min；大脑中动脉，20 min。温浴完成后，用吸管将酶液小心移去。将试管倾斜45°，缓慢加入2 ml室温的分离溶液以稀释残留的酶，终止其反应。动脉段放置在管中约10 min后，小心地移去试管内液体。向试管内加入0.5~1 ml室温的分离溶液，并用吸管反复吹打以分离出游离的VSMCs。细胞悬液在室温下可放4 h，在4 ℃冰箱中可放置10 h左右而保持活性。

使用本方法，我们成功分离出状态良好的隐动脉、肠系膜小动脉、大脑中动脉及基底动脉的VSMCs。我们分离出的VSMCs活性好，存活时间长。在电生理实验中容易封接和破膜，并成功记录出了各种K+通道电流和电压依赖性Ca2+通道电流。但未能成功分离出腹主动脉和颈总动脉VSMCs。这可能与这些传导动脉弹性纤维丰富而VSMCs少有关。

或者参考已经发表的文章中的描述

以戊巴比妥钠（40~50 mg/kg体重）腹腔内注射麻醉。取出两侧隐动脉自股动脉分出处向下2~3 cm长的一段[直径：380.0±78.3 µm（mean SD），n=18]及肠系膜前动脉支配的全段肠系膜，置于4℃的生理盐溶液中暂时存放。生理盐溶液成分（mmol/L）[2]：NaCl 137，KCl 5.6，MgCl2 1.0，Na2HPO4 0.42，NaH2PO4 0.44，NaHCO3 4.2，HEPES 10，硝普钠 30 µmol/L,通以95% O2和5% CO2的混合气体，pH值7.4。解剖大鼠左侧比目鱼肌及腓肠肌并称其湿重。将隐动脉及肠系膜转移到装有分离液的培养皿中。该分离液成分为加入1 mg/ml牛血清白蛋白的生理盐溶液。在解剖显微镜下去除动脉周围结缔组织及脂肪，并将隐动脉和肠系膜前动脉2~6级分支[直径：250.6±45.7 µm (mean SD)，n=16]剪成约1mm长的小段。将小动脉段分别转移到两个装有1 ml分离液及4 mg木瓜蛋白酶（Papain, 德国BIB）、2 mg二硫代苏糖醇（DTT, 美国Amresco）的试管中。置于36.9 ℃的水浴中温育（隐动脉33 min，肠系膜动脉25 min）。温育完成后经洗脱和吹打分离VSMCs。细胞悬液在室温（18~23 ℃）下可放置6 h，在4℃冰箱中可放置12 h，仍保持活性。

64、我想用膜片钳做心肌细胞钙离子通道电流的测量，我做的是全细胞模式的，不过做了4个月了还是没有测到过钙通道电流。不知道是什么原因。我们用的细胞是新生SD大鼠的心肌细胞。电极是国产的，没有抛光。细胞内外液成分是按照文献上写的配的，不过没有调节PH值（不知道这个影响大不大）。放大器是EPC10，我们破膜也是用负压吸破的，没有用ZAP。我现在还没有开始用灌流系统。测电流时没有出现钙电流曲线，而且电流值会随着电压的增大而增大的。不知道这是什么缘故？？？

电极内外液的PH一定要精确控制，这对细胞状态影响非常大。如果出现“电流值会随着电压的增大而增大的。"表明封接不好，可能没有形成良好的封接或者是破膜后封接也破了。膜片钳很大的功夫是要练习封接和破膜的方法，可能在这上面还要多下些功夫。

65、我还有一个疑问。我看的有关于用膜片钳检测离子通道的文献基本上都是阻滞被检测通道以外的通道，然后认为测得的电流就是该离子通道的电流了。好像没有讨论不同的离子通道之间的关系的，比如钠、钾离子通道的开、闭对钙通道的影响等，这是什么原因呢？我觉得不同的离子通道之间应该不是完全独立的啊

为了将问题简单化，研究某一离子通道的时候尽量用某些方法将其它离子通道的影响屏蔽掉，比如用钾离子通道阻断剂阻断后研究钙离子通道，同时用钳制电位让钠离子通道失活。就是为了让问题简单化。

当然也有专门研究某一离子通道对另一离子通道开闭影响的，比如有人做氯离子通道对钙离子通道的影响。

66、测电阻时,得到的电阻数值与放大器上显示的电流数值的乘积应该等于给予的电压数值吧, 可是,我计算后发现有差异,其原因是什么呢?有人急性分离肠平滑细胞不用充氧气吗?

在电压钳实验中，测电阻，不能用你这种方法。因为，零点会有漂移，不准确。

准确的方法需要用一个已知的方形波检测。已知方形波的大小（电压差），再看此电压引起的电流的差值（电流），运用欧拇定律，得到电阻。

67、我就是用这种方法分离的，可就是分离的结果不理想！细胞状态不好！是不是我的操作有问题？你在分离过程中给液体通氧气了吗？是全程通呢还是某一步通氧？我因为用的是胎盘血管，而医院离实验室有大约10分钟的路程，还有就是我从取到血管到分离大约要耽误30分钟。这些会对分离有什么影响吗？会不会细胞在我分离之前就已经死亡了呢？文献中说用1ml或2ml的分离液，而我一般用的比较多，因为我的血管段多一些，而且胎盘血管较粗，这些是否也会影响分离结果呢？

你用的是人胎盘的 血管吗？动物种类不同，分离的条件也有差异，你可以需要进一步摸索。氧气我一般是液体使用前通5分钟，不连续通气。我想胎盘血管肯定是选择的很粗的血管，而越粗的动脉越难分离出细胞，你可以在解剖显微镜下选择细点的血管，我做的大鼠肠系膜动脉直径才300微米左右。我也曾经分过大鼠的腹主动脉，没有分离出来。所以建议你还是选择细点的动脉吧。

10分钟的路程，如果是浸泡在液体中，应该没有问题。耽误30分钟也没有问题，不过这段时间最好把血管放到冷的液体中保存。细胞一般不会那么快死亡。液体量应该也不是问题。

总结起来：

1.选择细的血管，当然动脉容易分，粗的动脉弹性纤维太多，而平滑肌细胞太少，

2.液体pH要合适，

3.针对不同动脉，要多次摸索分离时间

68、我在作心肌细胞膜片钳，封接成功吸破后，总是记录不到离子流，我都快绝望了，就要毕业了，我还什么都没作出来呢，望指点迷经，谢谢！

老兄，不要着急，这种情况我师兄也遇到过，他五月份毕业的时候三月份实验没有进展，后来我有一个技术上的突破，在四月中旬他的文章就出来了，五月中旬录用，答辩。创下了学校研究生出文章的之最。做膜片钳的人都有这样的经历！

针对你的情况我考虑有以下方面的原因：1，首先不知道你做的是什么电流？各种电流的特性不一样，用的protocol肯定不一样，你一定要看你的protocol是否正确，比如慢钙电流，当不能达到它充分激活的时间，一定记不到电流。2，你封接的阻抗是否足够高，如果和串联电阻差不多的阻抗，那怎么会记录出来电流？3，细胞的状态是否足够好，这很重要！4，电极内液和灌流液的成分是否对？你不要告诉我你是从文献中看到的，文献有具体的情况，你一定要按照自己的实验分析成分的可行性！还有其他的方面要具体分析了！排除了以上的原因应该可以柳暗花明的！不要着急，着急没有用，要动脑，有深厚的理论知识，然后多交流，一定可以做的很好！

69、1）. 我用的 是AXON200B，SUBTRACK不好使，不能补偿漏电流，怎么回事

2）. 测膜电容还要有专门的电极内外液吗，怎么设置protocal

3）.吸破细胞后， 如何补偿膜电容和膜电阻，我经常补偿不好

1）.你的Leak Substract不好使指的是什么？据我所知Leak Substract在Axon上的补偿有好几种方法，但Leak Substract直接补偿使用起来比较方便，并且可以自动补偿，如果不能自动补偿一定是封接不是很好，而封接不好也要很多的原因。P/N补偿不容易掌握，在现在电流尚且不能记录出来的情况下我建议先不要补偿漏电流来记录电流，把工夫花在分离好的细胞或培养好的细胞以及练习封接和破膜上，在这个基础上才能更好的补偿，有的实验室其实根本不补偿，对有的电流如慢钙电流，快钠电流的影响就不是很大！

2），测膜电容的方法有很多，现在在Pclamp6.0和Pulse8.0以上的软件都有自动测CSlow的，你读数据就可以了。如果没有这个功能，测电容就很麻烦了。用一个Ramp Pulse（就是斜坡脉冲）扫描一次时程不要太长，不要激活任何的通道电流，当然闸门电流是不可避免的，而我们需要的是膜电容电流，它和电压的变化不是简单的比例！扫描一次后，得到一个曲线，对曲线下面积进行微分，所得就可认为是电容大小了。我认为电极内外液可以不更换，因为不会激活通道电流的！

3），还是提醒注意的是，你的封接一定要稳定，阻抗一般越大越好，破膜后不能小于100M，如果达到这个要求，你的问题应该能迎刃而解的。如果你做的是钙通道或钾通道，先不要讲完美，不补偿试试，等电流记录出来了，再来完美你会发现很简单的！

70、非常想知道几个问题，

1）、作patch clamp 时，电极内液是根据细胞内液来配制的，那细胞外液配制的根据是什么呢？

2）、经常看到为了记录某一个通道，电极内液和bath 溶液通常要更换或去除某一种离子，通常是那些离子来替换那些离子？

3）、作whole cell时，为了防止rundown，细胞内液通常加能量物质，Na2GTP 和MgGTP有什么区别

4）、EGTA经常用在细胞内液主要的作用是什么，其浓度是根据什么来设置的？

5）、hepes是为了调节ph吗？

1）.细胞外液的配置当然是主要根据体液的成分，体液主要是钠离子，因此细胞外液也主要是钠离子。至于体液中不具有的其他成分，有自己独特的作用，如下。

2），替换的离子有一定的依据，基本上有两点，如电荷化合价要一样，主要的是替换的离子不能通过所替换的离子进出的通道，如外液中用氯化胆碱代替氯化钠，内液中用铯离子代替钾离子。

3），Na2GTP 和MgGTP没有本质的区别，用哪个看你配方的其他成分，保持成分渗透压的稳定就行了，

4），EGTA是钙离子的络合剂，用来调节钙离子的浓度

5），HEPES是缓冲剂，调节pH值。

溶液的配制查阅文献然后大致了解其成分的作用就行了，关键是仪器的调试和细胞的分离培养！

补充两点

1)、替换的离子注意：渗透压平衡和酸碱平衡

2)、做单通道时用Na2GTP ，全细胞时内液加MgGTP

串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。

解决方法：1) 适当增大电极的口径，以利于破膜；

2) 电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；

3) 灌注电极液的器具也要保持洁净；

4) 电极现用现拉；

5) 电极下降入细胞外液时给予一定的负压防止此过程中灰尘堵塞电极

纠正一点：5) 电极入液前给予1-2cm水柱的正压可防止此过程电极的堵塞

71、我也是刚开始做心肌细胞不久，分离了有几次细胞，因为没有请landenff什么装置，所以是在体灌流清洗的，之后再取下剪碎酶解的。用的是0.05的胶原酶，消化半个小时后收集细胞的，不过没有收集酶解液的细胞，而是从新置换外液吹打组织块得来的细胞，刚拿到细胞时也有很多贴壁的细胞，但是杆状的不多，我想问一下多余的那么多的块状，椭球装的细胞是什么细胞，而且我们用杆状细胞进行封接时好象感觉没有细胞膜一样内容物很致密，电极根本抽不动，是什么原因呢？还有细胞好象放置一会就都漂起来了，我想问一下，我拿到的是不是也都是死细胞呢？还有，封接时没有用灌流系统有多大影响呢，是不是不加灌流细胞就会死，根本不能用呢 ？

你用的是那种动物，对于成年动物来讲，由于其胶原、纤维组织较多，必须灌流，才可以充分消化。你消化后得到的椭球状的细胞是可能是挛缩后的心肌细胞，如果你没有将血液清洗干净，有可能是红细胞。你分离出的细胞，在显微镜下如果看到清晰横纹，那是好的细胞。如果横纹不清，那一定是状态不好的细胞。无法做实验。在进行封接之前，一定要用灌流液，灌流5分钟左右，在整个实验过程中也要持续灌流，否则死亡的细胞释放出多种酶，及钙，死细胞的碎片也会影响封接，细胞也会缺乏养分，导致细胞状态不好。你电极吸不动，可能是你的电极尖端有垃圾（冲灌电极或进入灌流液导致的）。其实Langendorff装置很简单，用不了很多的钱，需要一个蠕动泵，一个超级恒温水浴和双层的玻璃管道。如果想的好的细胞，必须要有一个合适的装置。

72、我也是刚开始做心肌细胞钙电流测定不久，但是分离细胞一直都不好，昨天还拿到了些可以的细胞，但是一会就皱缩死亡了，今天和昨天的程序大致上一样，就是酶的浓度由0.05降到0.04，但是时间由8分钟延长到了15分钟，结果细胞全都死亡了，还不如昨天的细胞，请问这是不是由于酶解时间长了的原因。你一般都是酶解多少时间呢？我们用的是胶原酶2，是灌流消化的。我还想知道你们是怎么样逐步复钙的，还有细胞最后是保存在钙多大浓度的溶液里的。我们是保存在KB液里，但是没有逐步复钙。希望能解答的同仁们给予帮助。

我们用的电极内液的ATP也是冻存前保存的，一个月左右再次更换，不过我觉得有时候能用很长时间。不知道其他的师兄是怎样的呢 ？

1) 你在分离细胞的酶液中加入了多少钙，因为钙的量可以影响到细胞的酶解效果和细胞的存活。

2)酶量是一是一个重要的因素，但是你的改动太大了,你的酶量减少了0.01，但时间却延长了近一倍。你可以改变酶量，但不要变时间，或者酶量不要变改变时间，可以根据你开始分离出细胞的形态来判断是酶解过头，或酶解不足，如果细胞的量很多，而且碎片多，细胞横纹不清，表明酶解过头，如果细胞量不大，且圆球形的细胞较多，细胞悬液较清，表明酶解不够。我们做的是豚鼠，同样用胶原酶II ，用量大约14-15mg/40ml，酶解时间大约3分钟左右。

3）如果细胞保存在KB液中，细胞在复钙时钙的耐受性很差，会死亡很多细胞。我们复钙的protocol 如下

1）、取下心脏剪去心房，在含有20umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的20ml MOPS液中剪碎，吹打，温孵10分钟。2）、20ml mops 液+70ul 72mmol/L Ca 3. 20ml mops 液+14ul 720mmol/L Ca 4 .20ml mops 液+28ul 720mmol/Lca2+ 5. 20ml mops 液+40ul 720mmol/Lca2+ 。最 ca2+的终浓度约在1mmol/L



我们刚开始分心肌细胞的时候，也是总分离不出什么好细胞，请教过很多这方面的专家，提过很多建议，什么水要特别，需要测电导啦等等，其实根本没那么多的要求。根据我们的经验，水只要去离子水就行。一般溶液按文献中的配方基本没什么大问题。注意的就是pH值的调定，因为现在很多pH计用过一段时间后会不太准，但实际上对pH要求也不是太严格，我常常用pH计调定后，再用精密pH试纸测侧，大致偏差不太大就行。我们用的酶是胶原酶P（宝灵曼公司，现在被Roche公司收购），这是一种混合酶，不但有胶原酶的活性，还有一些蛋白酶的活性，因为心肌之间的成分很多，单一酶对有些成分的消化不太好。但也有只用胶原酶就能分出好细胞的，不必先换酶，再摸摸条件。

分细胞的时候，操作也很重要。取心脏挂上Langendorff装置要快。心脏周围成分的修饰可以等挂上Langendorff装置灌流时边灌边修饰。刚开始操作不熟练时，可以开胸后，先用4℃的冰台式液淋在心脏上，减少其活动性，降低其氧耗；剪下心脏后，放在4℃的冰台式液，稍加修饰，就快速挂上Langendorff装置。挂上装置后，我们就直接先用无钙台式液灌流冲洗干净心腔内积血，这时从心脏滴下的液体滴速要至少达到40滴/min以上，否则可能心脏内有微血栓形成，灌流不充分，这是不能分解出好细胞的重要原因。所以也有人在取心脏前，先心腔内给些肝素以防血栓的形成。无钙台式液的灌流一般5min就行，足够冲洗干净了，滴下的液体已经很清澈了。无钙液充灌也是使心肌细胞间连接松散的必须过程，但无钙液灌流太久，会使分离出的细胞不耐钙（参见文献Barbara B，et al. Life Sciences，1983；33：1-18）。然后换酶液灌流，酶液中钙的浓度50μM就行，不能太高，否则分出的细胞也不好。整个灌流过程中，灌流速度很重要（可以从液体滴速判断），所以灌流压力要保持，如果灌流过程变得太慢，说明灌流不充分，肯定分不出好细胞。至于酶解多长时间，没有一定，完全凭经验，即使同样的条件，由于灌流的情况不同，也会不一样，所以我不看时间。当心脏变得透明，快呈拉丝状了，就可以了，剪下心肌，稍稍吹打，就松散开了。没经验的时候，可以先剪一些右心房或右心室的组织，这样不影响灌流，看看能不能吹打开。至于灌流过程要通氧，保持恒温这些条件就不用说了，也是很重要的。根据我的经验，保持灌流速度是非常重要的，刚开始时我们分不出好细胞，主要就是灌流不稳定，在用酶液灌流一段时间后，滴速会非常慢。后来发现是Langendorff装置的挂心脏的头太粗，如果经主动脉插入过深，就会压迫主动脉根部的冠脉开口，导致灌流不好。你也可以多注意这些方面。

我们的细胞也是保存在KB液中，至于逐步复钙，就是配置不同钙浓度的细胞外液，从低到高逐步置换KB液，以免复钙后大多数心肌细胞又挛缩死掉。但这样仍是会有40％左右心肌细胞会挛缩死掉。

至于电极内液，我用过冻存过3个月的，仍旧有效。

73、做心肌细胞Ca2+通道电流记录是,电极内液PH值能用KOH或NAOH么,因手头没有CSOH.如果可以,那么用哪种更好呢?

如果是作全细胞，电极内液PH还是用KOH，更符合细胞内液环境，细胞外液加TEA阻断钾电流。

74、个人爱好指的是什么?我想听听您的心得体会.我现在的主要问题是不能形成高阻封接.

能否详细指教一下大鼠心肌细胞急性分离的准备过程?包括消化、灌流方面的细节。

我用过8MΩ的电极也能封接成功，首先细胞选横纹清晰、边缘清晰的心肌细胞，电极压到细胞后，阻值升高20～30％就不要再压了，即阻值8MΩ升到10～12MΩ。压太深很难封平。然后给负压，一般用10ml的注射器，预先抽到5ml处（这样抽负压时可以缓冲一下，不至于负压变化太快），然后往回抽最多1ml就足够，如果阻值不上升，给再大的负压也不行。细胞好的话，阻值升的很快，一会就达到GΩ水平；如果阻值升得比较慢，不要着急，可以停下等一等，有时候阻值会开始慢慢波动，一点一点升高，当阻值超过100MΩ后，这时阻值就会升高得比较快了。要有耐心，不要看到阻值不太升，就拼命抽负压，越抽越封接不上。我最长一次等了5分钟，抽完一支烟，它才升上去。

一般来说，电极阻值越大，越容易封接，但是越难破膜。而且，太大的阻值会影响HOLDING效果，对实验结果有影响，所以，对心肌细胞这样的大细胞，要求有较低的电极电阻。在文献上看到最小的电极电阻到1M。以上观点供大家讨论。

能否详细指教一下大鼠心肌细胞急性分离的准备过程?包括消化、灌流方面的细节。盼回复，谢谢！

1)预热Langendorff灌流装置，使其温度达到37oC左右（在Langendorff灌流装置的灌流液流出口处温度测量）

２）大鼠麻醉后取心,置于4 oC无钙MOPS液清洗，并剪去多余的组织。

３）迅速将心脏置于Langendorff灌流装置上，经主动脉逆向灌流,首先用无钙MOPS液灌流5分钟，以清除心室及冠脉系统的血液。

４）然后改用含48umol/Lca2+和18 mg左右的胶原酶（TypeII，I）、1%牛血清白蛋白的MOPS液灌流8-9分钟左右，灌流酶液时大约3分多钟拉丝，灌流完毕心室松软肿大，达到充分消化。灌流速度在9ml/min.

５）取下心脏剪去心房，在含有100umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎，吹打，温孵10分钟。

６）复钙，将细胞悬液过滤，逐步将钙浓度提高至1mmol/L，室温保存待 用。灌流液均用100% 的O2饱和。灌流系统的温度保持37oC。灌流液的pH最好调到7.2。

Shel

关于流速的问题。我们预先将流量调好，在整个灌流过程中，不再改变流量。我们没有采用任何干预因素，在整个灌流过程中保持相同的流速。

75、我想问一下你是怎么保持灌流速度的，依据我的体会，消化分离心肌细胞时先是流出液减慢（可能消化下来的碎片堵住部分血管），随着进一步消化，流出速度会加快（可能血管壁破裂，心肌细胞已连接疏松），你有采取人为干预的因素来控制灌流速度吗。

另外请问各位大侠：

我想做心肌细胞贴附式，假设静息电位是-70mv，如果我想把细胞钳制在0mv引出L钙电流，那我是要给予-70mv的刺激才能把细胞膜电位控制在0mv吗，如过我需把细胞控制在-40mv，那我又需给予多大的刺激呢，请指教。

Langendorf装置是靠重力势能维持灌流压的，所以保持液柱高度是重要的，滴下的酶液要反复循环利用。装置的玻璃管尽量细一些，50ml的液体应该要保持70cm高左右的水柱。消化分离心肌细胞时都会先变慢一些，但最慢的时候也不应该少于20~30滴,否则分离效果是不好的。至于另外的干预因素倒没有采取，主要是靠操作的熟练和迅速吧。

76、一般来说，电极阻值越大，越容易封接，但是越难破膜。而且，太大的阻值会影响HOLDING效果，对实验结果有影响，所以，对心肌细胞这样的大细胞，要求有较低的电极电阻。在文献上看到最小的电极电阻到1M。以上观点供大家讨论。

对于全细胞是应该电极电阻要求低一些的，这样串联电阻才低，钳制误差才小。我只是针对刚开始做实验封接还不能成功的情况，先能把电流引出鼓励一些士气，至于做的完美是后一步的事。

77、可我还是有个比较简单的问题不明白，在逐步复钙时，不同浓度钙的溶液时陆续加入细胞悬液的呢还是更换呢，如果是陆续加入，那最后的体积一定很大啊，是怎样浓缩细胞的呢，是离心还是静置然后弃上清呢？如果是置换不同的溶液，那更换溶液时是不是也要离心或者静置呢 ？好像没有见过离心收集细胞的，那要是静置有的文献上说要等半个小时左右细胞才完全下沉的。因为没有见过究竟是怎么样提取心肌细胞的，所以又很多的问题不明白，希望能得到大家的帮助。

逐步复钙，我们是更换不同浓度钙的溶液，细胞悬液放在试管中静置，细胞下沉后，抽掉上清夜，加入低钙溶液，15min后又抽掉，再换高些浓度的钙溶液，如此而已，不要想得太复杂。

78、1)、我们也用胶原酶P，浓度3 mg/40ml，以前分离的细胞很好，可是近来却很不好，主要是给负压的时候细胞就收缩死亡，你认为这是哪里出了问题？

2)、你在做实验的时候是不是对室温也要有要求，这两天天气很冷，我们这里室温大约17，8度，这个会不会有影响，

3)、另外对于你说的插入主动脉的管不能太粗，我这里用的大概直径是2 mm, 不知道是否合适，你们用的大约有多粗？

1).不知你分离的心肌细胞是大鼠的还是豚鼠的，大鼠我们的酶浓度高些，6mg/50ml；豚鼠小些，4mg/50ml。但我感觉胶原酶P不同批号活性有一些不同。但实际上实验中酶浓度稍稍偏差一些不太要紧，我称酶的时候常并不精确去称量，大致就行，因为最后酶解停止的程度也是靠自己的感觉。我感觉豚鼠心肌细胞好分些，消化时间短些，刚分下来的好细胞数量多些。

至于给负压的时候细胞就挛缩，一是可能你选择的细胞本身就不太静止，有时候不仔细看看不出来，盯着看一会就会发现它偶尔会动一下，这种细胞尽管胞膜边缘清晰，横纹清晰，也不能用。反而是那些看起来并不是非常清晰，而静止的细胞可用。二是你下电极压得细胞太重了，所以一给负压就动起来。三是负压给得太大也会这样。至于下电极压细胞多深，给负压多大，我在中谈过。

如果你的细胞分得稍稍有些不够，细胞表面有纤维组织，可能会使你下电极压细胞后电阻没有什么反应，导致你压得过深。或者bath液灌流不太干净，电极尖端入液时碰上脏东西，也会导致电极压细胞后没有反应。

2). 我们做实验时对室温没有特别要求，因为没有这个条件去控制。至于天气稍冷些，文献上说对延迟整流钾电流会有影响，引出电流变小。但对封接的影响我还没碰到过，也没有见过这方面资料。所以气温因素可能不是主要的。

3). 至于插入主动脉的管不能太粗，直径我还真没测过, 只知道原来的管头和主动脉管径差不多，甚至还粗一些，挂心脏的时候，要把主动脉撑开，勉强挂上去；现在的管头明显比主动脉管径细，很轻松挂上去，还留有许多空隙。

79、我们想做全细胞模式。我们拉的电极在给正压入水的时候电阻值7～10M；去掉正压后电阻值下降到2M左右。这样的电极是不是有问题？还有，电极尖端的形状到底是什么样子的，具体的图形是什么样子的？

这种现象我也见过，应该电极没问题，我们用这种电极做实验结果也挺好。但这种现象是什么原因不清楚。如果电极有气泡的话，加正压电阻应该变小，因为气泡压缩了。不知哪位高手有什么见解。

这种问题多半是电极内部脏了，一些异物留存在电极头部。施加正压，异物堵住电极尖端，电阻升高；放掉正压，异物退回，电阻降低。

80、请问记录L型钙电流时细胞是一直置于记录钙电流的细胞外液，还是先置于台氏液，等高阻封接吸破细胞后再换为记录钙电流的细胞外液？？

可以一直用细胞外液。这样比较省事，对结果也没有影响。

膜片钳之实验操作篇膜片钳之实验操作篇



81、我们用的是0.04％的胶原酶。这样看来我们的浓度是有些高了，而且我看到有的酶解时间就只有3－4分钟，从开胸到开始灌流的时间大约是6－7分钟吧，因为插管不熟练，费了点时间，最好是多少呢？而且有的师兄说的心肌呈拉丝状是怎样的呢？是不是心脏表面的纹络？这个是酶解较好的标志么？

0.04%的浓度是有点低, 我个人认为酶解3-4 分钟是不够的,可能与酶的种类不同有关吧,从开胸到灌流的时间越短越好,一般在3-4 分钟, 应该是先挂上心脏, 再修剪, 而对于心肌呈拉丝状指的是流出的液体的形状,而不是心脏的形状, 这一般被认为是酶解好的标志, 我也做的不是太好，希望对你有帮助。

82、生理学报, Dec. 2002 , 54 : 525～530上的文章《四周模拟失重大鼠后身动脉平滑肌细胞钾电流的改变》中记录钾离子通道，但是浴槽灌流液和电极内液都没有采取对Na通道和Ca通道的阻断措施（除EGTA外），并且给予－70mv的holding 电位，也不能排除Na通道的激活，请问如何能确定所记录到的电流中没有Na和Ca通道的成分？



另外文中提到“这种对3mmol/ L 42AP 敏感的电流在膜电位附近即已被激活(图1 D , 2 Ac , 2 Bc) , 根据其电流特性, 可知其为KV 电流[7 , 8 ] ”,此处我对这里膜电位的概念也觉得有些模糊，这里所指的膜电位是不是特指？不知bingman试验中所用的4－AP及TEA是从哪里订购的？

血管平滑肌上的离子通道和心肌的是不一样的，据我所知，目前在平滑肌上还没记录出钠通道电流。血管平滑肌(VSM) 膜上有四种不同类型的钾离子通道、两种电压门控钙离子通道、两种氯离子通道、储存操纵钙离子通道及牵张激活阳离子通道。钾离子通道分别为电压激活性钾通道、大电导钙激活性钾通道、内向整流性钾通道、ATP 敏感性钾通道；钙离子通道为L型电压门控钙通道及T型钙通道；氯离子通道分别为钙激活氯通道及容积调节氯通道。所以文章中没有采取对Na通道的阻断措施。至于钙通道，不能保证记录出的电流中没有，但文章中解释过，钙离子通道会在长达2s的刺激末端完全失活，而测量钾电流的值时是在钙电流失活后的时段测量的。

KV 电流在膜电位附近即已被激活，应该是静息膜电位吧。老兄可以找点关于平滑肌离子通道的资料，尤其是关于KV 电流的，可能会有帮助。关于这方面我了解也不是太多。

4－AP及TEA当然是Sigma公司的，代理公司太多了，随便哪家都有卖。



血管平滑肌细胞上未见有钠离子通道的报道，所以不用阻断钠离子通道。

钙离子通道电流与钾离子通道电流相比十分小，而且会很快失活，不影响钾离子通道电流的测量（一般800ms左右才开始测量，本实验中测量是在1600ms处）在正常外液钙浓度下最大电流一般小于50pA，最大电流出现在30ms左右，所以钙离子通道电流的影响也很小，所以也就不用阻断了。况且加入阻断剂由于其毒性、特异性等问题，对记录反倒不利。

这里说的膜电位指的是细胞静息情况下的电位，也就是I-V曲线与X轴的交点处。

在I-V曲线中，横轴一般标记为Vm(mV)，其中的Vm就是膜电位的意思，这是因为我们不同的刺激电位实际上就是人为控制了细胞的膜电位，以测量细胞在不同膜电位下通过该通道产生的电流大小。

我所做的实验中关键试剂均来自美国Sigma公司，因为这个公司的试剂纯度高，可靠。

纯氧气或者CO2+O2都可以，根据我实验的经验两者没有区别，关键是液体要在使用前充氧（指的是配完后冷冻过的液体）。

一般充5分钟足够。

再次提醒一句，PH值对于分离细胞十分重要，比充氧重要的多。要买个好点的PH计，调准确，不能依靠试纸。我用过几种试纸，尽管是精确型的，但敏感度太差，同样一个颜，有的人读成7.6，另一个人可能读成7.2，误差大。所以不要用。

83、今天我们分离心肌细胞，先用无钙台式液体灌流5分钟，滴下的溶液基本上很清澈，然后用0.04的胶原酶灌流6分钟，然后剪下心肌剪碎，吹打孵育10分钟，但是得到的细胞还是死细胞，，其中的溶液都事先用氧气饱和的，温度在34－35左右，灌流速度是每分钟8－10毫升。有哪位高人指点一下，究竟可能是什么原因呢？

你取下心脏到恢复灌流的时间要尽量短，我现在基本上30秒搞定，消化的时间很重要，这没有固定时间，以心脏变软，流出液拉丝为准，最好在37度水浴中剪碎，少量吹打几次就下来，温度可提高37度左右，不要低于36度，灌流速度是可以的。另外你用的胶原酶的效价是多少的？？

84、可是我看这方面的文献都有1个月了，还是有些摸不着头绪，郁闷得要死！

因为我一直都没有找到关于血管平滑肌细胞上离子通道的综述，那种比较详细介绍各种离子通道开放的时间和性质的(其实不管什么细胞上的离子通道的综述都会有帮助吧)，所以对那种离子到底什么时候发生什么样的变化一直都很不清楚，不知二位师兄及其他高手手头是否有类似的文献介绍？ 不胜感激。

我主要想做KATP通道，按照你文章生理学报, Dec. 2002 , 54 : 525～530上的文章《四周模拟失重大鼠后身动脉平滑肌细胞钾电流的改变》所示，用4－AP、TEA阻断KV及BKCa后，剩余的电流就是线性漏电流、KIR和KATP等电流等，如果我需要的是KATP，我可不可以通过阻断KV和BKCa得到？软件是否可以将得到得两组电流相减，得到想要的电流？ 有些文献中不用这些阻断剂，只在电极内液中加入ATP，再用KATP激动剂如Levcromakalin或pinacidil等来激活KATP，有的这些都不用，只是改变command和holding电位就得到，何故？



另外，关于那个command voltage，我还是一直不太明白，如果细胞膜被holding在－70mv，那么在给指令电压时，从－60～＋60mv，每个sweep，增加10mv，那么，细胞膜是不是将依次被除极至－60、－50、－40、－30....＋60mv，在这个过程中，其他的电压依赖性的通道难道不开放吗？比如在－40mv时Kv的开放？ 这个holding电压和不同的command电压不是为了得到特定的通道电流吗？ 再说，为了更详细的观察整个除极、复极过程中KATP的电生理特性，多数如上面的那个protocal是不是只假定了除极过程而不牵扯复极呐？



很多研究KATP的文献中holding电压和command电压都不相同，如何选择？



另外，关于那个command voltage，我还是一直不太明白，如果细胞膜被holding在－70mv，那么在给指令电压时，从－60～＋60mv，每个sweep，增加10mv，那么，细胞膜是不是将依次被除极至－60、－50、－40、－30....＋60mv，在这个过程中，其他的电压依赖性的通道难道不开放吗？比如在－40mv时Kv的开放？ 这个holding电压和不同的command电压不是为了得到特定的通道电流吗？ 再说，为了更详细的观察整个除极、复极过程中KATP的电生理特性，多数如上面的那个protocal是不是只假定了除极过程而不牵扯复极呐？



holding potential 就是在记录间期认为控制膜电位Vm到这个数值，借此将一些具有失活特性的通道关闭（比如钙通道、钠通道）。之所以能让一些通道不开放，是因为在这个电位下，这些通道由静息状态---->失活状态，而处于失活状态的通道要恢复为静息状态的通道需要较长时间，在command voltage 作用这段时间很难恢复，所以也就记录不到该通道的电流了。



command voltage 其实也是将膜电位Vm临时变化到这个电位，看这个电压下能记录到的电流，借此了解整个细胞通道开放情况（电导）。command voltage 作用时间短，然后很快又回到holding potential 。

85、请教做过平滑肌的各位两个问题：

1）：有没有记录到过自发性的动作电位（不施加任何影响因素），单个或是串连的？？？常见吗？？2）：一个平滑肌最多能连续记录多少时间？？？？

平滑肌细胞没有动作电位，别说自发的，就是给予强刺激也激发不出来。至少我没有记录出来过。连续记录1小时应该没有问题。

86、我想作急性分离的肺动脉平滑肌细胞全细胞记录模式。关于平滑肌细胞的分离，中文资料中用到的试剂有：胶原酶，牛血清白蛋白，木瓜蛋白酶，二硫苏糖醇。英文资料用到得试剂有：木瓜蛋白酶，二硫赤藓醇，H型胶原酶和F型胶原酶.到底哪钟方法分离的效果好 。还有，木瓜蛋白酶有好几种，该选哪种。

参阅：生理学报, Dec. 2002 , 54 : 525～530上的文章《四周模拟失重大鼠后身动脉平滑肌细胞钾电流的改变》

里面用的分离方法比较简单，也可成功分离出细胞。

分离的时候注意：要选择比较细的血管，越粗的动脉越难分成功。我成功分离了大鼠肠系膜小动脉、隐动脉、大脑中动脉的VSMCs，用的就是木瓜蛋白酶。

87、请教：我想做大鼠胸主动脉平滑肌细胞的全细胞膜片钳，我查了一篇文献用了木瓜蛋白酶分离，请问大概用什么型号的木瓜蛋白酶分离？各位做过大鼠胸主动脉平滑肌细胞的你们是怎么分离的？

这么粗的动脉很难分离出来。

88、请教：我想做大鼠胸主动脉平滑肌细胞的全细胞膜片钳，我查了一篇文献用了木瓜蛋白酶分离，请问大概用什么型号的木瓜蛋白酶分离？各位做过大鼠胸主动脉平滑肌细胞的你们是怎么分离的？

大鼠胸主动脉平滑肌细胞我们分过，效果还不错，用的是两步酶解法，参考文献见：Michael Rubart，Joseph B，and Mark T. Nelson. Ca2+ Currents in Cerebral Artery Smooth Muscle Cells of Rat at Physiological Ca2+ Concentrations. J-Gen-Physiol，1996；107：459-472. 只是酶量上稍有调整。木瓜蛋白酶，我们选的是Sigma公司产品中最便宜的那种，忘了型号了。

89、是用这篇文献中分离大脑后动脉平滑肌的方法来分rat的主动脉平滑肌细胞？细胞状态如何呐？钳细胞没有问题？使用的酶量具体如何调整呐？？

我们摸索的几种成分的量是：albumin 2.5 mg/ml，DTT 1.5 mg/ml，papin 1.5mg/ml，collagenase 2.5 mg/ml，hyaluronidase 2.5 mg/ml. 分的细胞状态很好，镜下成梭形或香蕉状。后来我们分成熟后，把酶量降下来，调至和文献一样，也能酶解出好细胞。所以酶量不是关键，酶量少一些可以适当延长一些时间，重要的是判断酶解每一步到什么程度该停止，把握这个火候。一般第一步剪成的血管块酶解成接近粘稠的脓鼻涕状（这个形容太恶心，但不知怎么描述恰当些）。然后迅速转移至第二个含酶的小瓶进行第二步酶解。由于平滑肌个头小，封接比心肌困难，破膜时也比较容易掉。但要有信心。

90、师兄，请问您再分离时需要持续通氧气吗？

血管段剪的很小吗？您一般分离多长时间呢？所用液体是当天用当天配制吗？还有就是酶解完以后吹打时大概要多久呢还是多少次？有什么判断标准说明单个细胞已经吹打下来了呢？我现在真的是有点失去信心了，感觉很无助，而且看不到希望呀！

1）、不需要持续通氧

2）、血管剪的越碎越好，<0.3mm

3）、我分离时间25分钟左右

4）、液体都是配一瓶500ml，使用一周左右

5）、吹打1分钟足够了，一般液体会变浑浊

6）、判断标准就是去一滴到显微镜下面看



分离时是持续通氧的。血管段剪成1mm见方的样子。一般第一步酶解20分钟左右，第二步15分钟左右，至于取血管和修饰、用棉签擦内皮看个人的熟练程度。判断单个细胞已经吹打下来，当然是放在镜下检验了。一般轻轻吹打5分钟足够，如果这样镜下还没有单个好细胞，说明酶解不好，再吹打也没用。

91、请教一下：我是做全细胞的，现在我做的时候，破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。有没有什么办法解决？

其原因可能是破膜不全，有两点建议：

1.封口后可以再加用小负压直抽，看是否能再拉开。

2.一般做全细胞时易封口也可能是直抽时负压太小或抽得太慢，可以考虑将电极阻抗适当调小点，这样尖端大一些可以破膜更好一些，不过一般不超过2－5兆。

92、我在一篇文献查到记瞬时外向性钾电流的protocal:钳制电位-80mv,先去极化至-40mv，持续30ms，以灭活钠电流，给予测试电压-40mv至+60mv，步长10mv，时程200ms。外液中含有TTX0.2,Cdcl2 0.3,Bacl2 0.3。标准电极内液。

文献上说这样记出来的就是瞬时外向性钾电流。我的疑问是：延迟整流性钾通道是怎么阻断的？

你看的文献一定说的是大鼠，因为在大鼠上一般记录不到延迟整流钾电流；豚鼠上很难记录出瞬时外向钾电流。这是种属的差异。所以实验要记录哪种电流，需要选择好动物，否则会出笑话。

93、这里的持续通氧是在血管取出后的修饰、去内皮外膜、及剪成小碎块的所有过程都通氧吗？第二步酶解后有没有酶解终止的步骤？

持续通氧是在血管取出后的修饰、去内皮外膜、及剪成小碎块的所有过程都通氧。这些过程都是在一个大培养皿中操作，可以从氧气瓶中联一个很长的细管子，前面接一个针头，贴在培养皿壁上，用夹子夹住，持续通氧。我们喜欢用氧气袋充氧后来通氧，感觉安全一些，比一个大氧气瓶靠在身边感觉好多了。另外酶解过程我们也通氧的。

第二步酶解后的中止就是把酶解成糊状的组织块用吸管从盛酶液的小瓶中转移到干净细胞外液里，换两道液，基本上就行了。

94、还有，使用的collagenase F和hyaluronidase Ⅱ－s是sigma的吗？我怎么在sigma的商品目录上没有查到? DTT的货号也有好几个，具体用哪个呐？



我们用的不是collagenase F和hyaluronidase Ⅱ－s，而是sigma上有的：C8051 blend Collagenase和H3506 Hyaluronidase，D9779 Dithlothreitol，当时选的都是便宜的。

95、请教一下各位：我做急性分离的心室肌细胞，记录Na电流，是新手，当用细胞外液冲洗细胞时，细胞不稳定，全部收缩，以致于影响后面的封接。细胞状态怎么这样不好呢？

多指教。

细胞状态在冲洗之前如何，如果不错的话可能有三个原因：

1） 细胞外液的PH调的对不对？

2） 温度是否过低？

3） 冲洗速度是否过快？

96、该配方无需考虑钾通道的rundown吗？我看有些文献中电极内液要加入ATP的，但我做KATp，本身胞内ATP就会抑制KATP电流，所以在考虑电极内液的配方时就出现了矛盾，请问如何解决？再者，前面有人提到过标准电极内液，又是指什么？

至少我没有听说过钾离子通道电流存在Rundown,况且即使存在,ATP对它也没有用.

一般说Rundown主要说的是钙离子通道电流,可以加入ATP延缓Rundown的发生.

所以如果是做钾离子通道电流,就不要使用含ATP的内液,换一个不需要 ATP的配方吧.

电极内液成分应该与细胞内液成分基本接近,然后根据特殊需要做一些调整,到要满足渗透压应基本与内液等渗,以防细胞萎缩或膨胀.

97、可是我破膜后阻抗一直维持在200M以上啊，漏电流也不大啊。

如果真的是200M,那漏电流可不小的.我的细胞破膜后,-70mV电位下,阻抗一般在2G左右,否则漏电流会很大,不信你自己计算一下,100mV/200M= 500pA

当细胞去极化的时候(比如+40mV刺激时),阻抗会进一步减小,漏电流会更大,甚至比你要的电流大很多.

98、计算漏电流为什么要用100mV/200M呢,我用的EPC-10界面上I-mon,我以为它检测的就是漏电流呢.另外,做钾电流时一定不要加ATP吗?原因是什么呢?

这里用100mV是因为一般我们刺激电位的最大与最小之间一般也就100mV左右，这样即使没有通道电流，两个刺激电位之间的电压差也可以产生500pA的电流。

破膜后的阻抗至少应该在1G以上，并且在整个测试过程中，基线部分（就是刺激电位尚未开始的部分，就是你的图形中左边的那一段）各线不应该分开，应该基本在一个水平。否则就说明细胞掉了，或封接的不牢固。

99、做急性分离的心肌细胞时，在显微镜下看到电极接触到了细胞，

可是电阻没见升高，给负压也没见升高（或升高很少，1～2M）。

选择贴壁状态较好（移动载物台，细胞不随液体晃动）、在10×镜下有明显条纹状的杆状细胞。或者是，电极稍微接触细胞，细胞就缩掉了，有点象絮状物。我们可以想到的就是可能细胞本身状态不好，但是有没有可能是其他因素？

另：我们在10×下可以看到明显条纹，也能看到一圈黑色的细胞膜，但是在40×下看不清细胞膜。如果排除显微镜的原因，还可能是什么原因？

我的细胞也遇到过这样的问题!

如果你的细胞是要经过酶消化的话,可能是消化过了!你可以考虑改进消化,减少酶量或减短时间.基本不是仪器的问题!

100、我做急性分离的心室肌细胞，记录Na电流，是新手，当用细胞外液冲洗细胞时，细胞不稳定，全部收缩，以致于影响后面的封接。细胞状态怎么这样不好呢？

换细胞外液时一定要慢点,千万不要在细胞的正上方滴外液.要从边缘吸取液体.如果你的细胞缩掉了!可能是你的外液的渗透压过高了!

101、请教一下：我是做全细胞的，现在我做的时候，破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。有没有什么办法解决？

建议做穿孔膜片钳

102、请问各位高手,全细胞模式记录大鼠心肌细胞L-Ca电流是否一定要用4-AP?能提供配方吗? 那倒不一定。你可以把电极内液的K+用Cs+代替，或者用TEA抑制钾电流也行。

103、应该可以，我见过有文献不用4-AP,我也试过，也可。但我的渗透压还没有调整好，我也在找更好的配方。你可以找找文献。我们可以加强联系，我也做大鼠心肌细胞膜片钳。

另外，我想问问你们的4-AP,TMA,CsOH,CsCL，TEA是那家公司的，质量如何，价格是多少？我们想买。你用什么酶，效果如何，价格是多少？我在电极内液和细胞外液都用了TEA-Cl，仍然没有记到Ca电流，是什么原因？我可以看一下你记录的Ca电流吗?

我这里没有4-AP,只有TEA-Cl,sigma公司,427RMB/25g.CsOH,sigma公司389RMB/10g

我的4AP刚刚没有,所以我目前的钠电流是在无4AP的条件下记录到的,无4AP的钙电流即将要做.因为我见过不用4AP的文献记录钙电流,而且我已经用无4AP的浴液记录到钠电流,我想钙电流应该没问题,所以打算试一下.就如我楼上那位所说,我想可能是细胞的问题.

应该可以，我见过有文献不用4-AP,我也试过，也可。但我的渗透压还没有调整好，我也在找更好的配方。你可以找找文献。我们可以加强联系，我也做大鼠心肌细胞膜片钳。

另外，我想问问你们的4-AP,TMA,CsOH,CsCL，TEA是那家公司的，质量如何，价格是多少？我们想买。你用什么酶，效果如何，价格是多少？我用的是胶原酶2, 290RMB/100mg.

Ca bathing solution mM MM g/200ml g/100ml

CaCl2.2H2O 2 147.02 0.059 0.0295

TEA 135 183.73 4.96071 2.480355

4-AP 5 94.12 0.094 0.047

MgCl2.6H2O 1 203.3 0.041 0.02

Glucose 10 198.17 0.39634 0.19817

HEPES 10 238.3 0.477 0.238

PH=7.4 With CsOH

Ca pipette solution mM MW G/100ml G/50ml

CsCl 130 168.36 2.189 1.09434

ATP 2 551.1 0.11022 0.05511

EGTA 5 380.35 0.190175 0.0950875

HEPES 5 238.31 0.119155 0.0595775

这是我们记录钙电流的配方,没问题的,希望对你有帮助。



谢谢你的配方,回头我按你的配方试试.只是4-AP不太好买,需要公安局的证明.

我分离细胞的流程其实也挺简单,操作如下:



腹腔注射麻醉剂(戊巴比妥或乌拉坦)后,剪断颈动脉放血,快速开胸取出心脏,置于冰盐水中修剪后挂在landeroff装置逆灌无钙台氏液约5min,随后用含胶原酶2(10mg/50ml)的无钙台氏液酶解15-20min,再用无钙台氏液约50min冲洗后,剪碎置于KB液中吹打散开,然后200目尼龙筛过滤

104、有个patch配方的电极液要用HEPES－trisoh做缓冲调整ph值，怎么配啊？还是有现成的试剂？

先将电极内液的所有成分溶解以后,再将其用PH计测PH值,肯定是离要求的PH值很远,用磁力搅拌棒一边搅拌一边往溶液中加HEPES－trisoh,同时用PH计监测PH值的变化,使其达到所规定的PH值.

105、有几个问题想请教一下：

1 如何在电极入水前加正压？

2 如何观察封接后的电阻值变化？

3 千兆封接后，给以负压，示波器提示已经破膜，但引不出电流，不知是何 原因？

4 破膜后多长时间开始记录电流？

最后，能否把中科院细胞培养所与德国马普实验室patch clamp 培训班的ppt 给我也发一份？

1） 如何在电极入水前加正压？

你用的axon 的机器吗,在他的说明书上有关于如何给压力的方法.另外,前面有帖子提供了一种加负压方法,只要把水面灌的高一点,就可以给正压了,只要向里面注入气体就可以了 ,不过要小心,不要太多阿 .

2） 如何观察封接后的电阻值变化？

axon的pclamp的 seal test 或者membrane test 上有直接的显示阿 .看就知道了.

3) 千兆封接后，给以负压，示波器提示已经破膜，但引不出电流，不知是何 原因？

看看Ra是不是太大了,要是的话可能是电极又堵了,或者是不是 漏电流太大了.

4) 破膜后多长时间开始记录电流？

看各项指标,稳定了就可以了 .但有的时候细胞的通道有衰减的 ,要尽快做阿 .

106、我试着用我分离的细胞封了一下,老是掉,更别说破膜了,而且室温下只能保持不到2小时的活性.

还有,在显微镜下怎样识别一个分离出来的细胞状态的好坏

按照你的分离步骤,封接时将细胞悬液滴入培养皿再加入灌流液,但细胞悬液中含有牛血清白蛋白,这样会不会影响封接呢.

平滑肌细胞封接难度很大，电阻上升特别慢，一般需要半小时以上才能达到2G的电阻，随后的破膜难度也很大，成功率30%左右，即使破膜成功，还有很多细胞根本记录不到电流。

细胞状态的好坏，如果从形态上看，主要就是要求表面光滑。具体的东西有些需要看多了以后的感觉，无法简单地用语言描述。

牛血清白蛋白对封接影响不大。拍照片就是用显微镜下上面连接的照相机直接拍照，然后扫描进去的。没有什么特别的，哪位知道如何让电极镀氯化银。

买一节5号电池,找一个培养皿,放一些NaCl溶液,把电极用一根导线连接到电池的正极,另一根导线连接电池的负极,将两根导线的另一端同时放入NaCl溶液中,1-2分钟后,电机的尖端变黑就可以了。

我再试一下，看怎样。不过我看到关于这方面的报道说不让用新电池，是否就是防止电压太大呢！能否聊聊关于PATCH方面的问题。还有一种可能就是你的电极是Pt制成的，这样的话是镀不上的。这种电极是不可逆的，但无损耗！

107、我做KATP，实验中要用pinacidil。用DMSO溶解配制成母液，可见溶解很好液体透明清亮，可是当我缓慢加入蒸馏水试图稀释时，却总见pinacidil又重新变的不溶解了。还有glibenclamide也出现这种情况。

哪位大侠也用过这个试剂，配制时有什么诀窍？

你用的DMSO的浓度是多少的？？在我们实验室是用10％的，量掌握在能把药物溶解就好了。DMSO的终浓度一定要小于0.1%。 还有如果这个方法不行，可以用无水酒精试一试。

先将pinacidil或glibenclamide溶于DMSO（如配制5ml需DMSO2ml），完全溶解后，一滴一滴滴入含一滴NaoH的双蒸水中，同时搅拌（不能将双蒸水加入DMSO溶解配制成母液中）。这样就不会析出了。注意最终用药浓度DMSO需在0.1％以下。

108、各位师兄：

我们现在分离出了心肌细胞，保存在无钙KB液中， 1～2小时后用于实验。

实验时直接将无钙KB液换成含0.3mM钙的细胞外液。细胞不是死了就是开始跳动。不知道各位师兄是怎么让细胞即保持活性，又不让其跳的？是不是加入钙后都会有这样的结果？

我们要测全细胞的钙电流。到目前为止还没有测到一个成功的。

复钙后，收缩的心肌细胞已经发生钙转运异常，这种细胞是不能用来做膜片钳的。只有复钙后保持静息状态的细胞才能用来实验。一般分离的好的话，复钙后有1/3的细胞能保持静息状态。请从细节入手，慢慢摸索！

109、一滴一滴滴入含一滴NaoH的双蒸水中，是不是说NaOH含量很少？

为什么加入含NaOH的双蒸水就好了？是ph影响还是其他什么原因？如果是ph影响的话，那加入浴液中进一步稀释时，ph又回到7.4左右，药物岂不是又要析出？

另外，你加过含NaOH的双蒸水的pinacidil/glybenclamide应该也可以做母液储存

是ph影响药物的溶解。稀释后药物量很少，一般不易析出。Pinacidil配制后室温保存不会析出的，4度可能会析出

其实在整个实验过程中,从断头取脑开始,经历切片,温育,消化,吹打,贴壁,记录中,都需要氧气,大部分时候可以不断补充新鲜氧气,还可以更换富含氧气的新鲜的灌流液.

110、请问做膜片钳的细胞状态（活性）怎么测定，最常用的有那些方法？ 简便而又公认的又有哪些？ 谢谢！ 最后，是不是做膜片钳都要测定细胞状态（活性）的



细胞活性一般都是在显微镜下观察的。一般来说活性好的细胞在镜下看胞壁光滑，比较透明，折光性好，细胞内没有粗大的颗粒，电极尖接触细胞时可以感觉到细胞弹性好。存活时间长，封接容易，细胞不易崩解。

做膜片钳不需要专门测定细胞活性，至少我们实验室没有专门测。

不知道各位做膜片钳的战友现在都进行到那一步了。我做的是急性分离的肺动脉平滑肌细胞。在经历了寻找分离肺动脉，分离单个的平滑肌细胞，从细胞状态不好到现在分离的细胞状态还可以，封接还比较顺利。但现在我的实验又进入了新的困难时期，破膜时细胞很容易掉，不易打破，或者破膜后，总是计不到满意的电流。不知道，诸位战友中，有没有哪位曾经遇到类似的情况，可否指教一下。不胜感激。

最后，还想鼓励一下正在困难中前进的朋友们，不要灰心，坚持下去，总是会有进步的！

111、我想做PC12细胞的钙通道，但对电极内液和外液的配方，不是很有把握，草拟了一个方案，请各位提提意见和建议,谢谢！

外液：Nacl 110,CsCl 5,MgCl2 0.6, BaCl2 20 ,HEPES 5, Glucose 10 tea-cl 20, PH7.4 With NaOH

内液：CsCl 130， MgCl2 2， Na2ATP 2， EGTA 1.1 CaCl2 0.1,Nacl 10,HEPES 10, PH 7.2 with CsOH

我感觉配方还是看文献，可以用它们的配方阿。而且关于p12细胞钙通道做得很多，成熟的配方应该很多。

在者，如果是自己拟就的配方，渗透压很是个问题，如果你有渗透压仪，就好办了。调渗透压的电极内外液的渗透压要和你的细胞原来生存环境的压力一样，而不是追求300左右，没准你的细胞原来所在的环境是320呢。

至于调节ph，还是用CsOH,否则你辛苦配制的液体因为调节ph而混入不应该有的离子，很不应该阿。CsOH也不难买啊。

112、我主要做血管平滑肌细胞的急性分离，然后做膜片钳。

据我所查的资料，溶液中一旦加入了消化酶，就不宜再充氧气。因为冲气过程会破坏酶，而降低酶的消化效果。所以我想应该是先充氧气（如果需要的话），再加入酶。

113、各位师兄我作急性分离心肌细胞。也没有人知道，自己摸着作，分细胞半年了，老是不稳定，大家能给我点意见，分得什么程度算是好了，复钙后细胞存活的不多，并且都奇形怪状的，什么样的细胞可以上膜片钳了？谢谢各位了先！这是我分得细胞找到的我认为最好的一个细胞，请大家看看这样子能作膜片钳嘛

照片并不是很清楚，就照片上显示的来说，这样的细胞比较难做膜片钳。细胞一端（上端）有变圆，即边界不是很清晰；细胞横纹不清晰；细胞有明显的纵纹，象是有一定的收缩。这样的细胞是比较难做的。

好的细胞模样，你可以参考以前的帖子，慢慢的把以前的帖子都看一看，你就会有收获的。

114、谁急性分离心肌细胞用的sigma公司胶原酶2型啊，我分出来的细胞边缘总是不整齐，且很多缺一块，细胞数量也不是很多 我得酶浓度是11.4mg/60ml消化时间大约6分钟，大家给我点指导啊，消化完没有中止直接将心脏取下在孵化液中剪碎的的，小弟情大家给点建议啊，先多谢了！

急性分离出的心肌细胞边缘是不整齐的，但是好的细胞是棱角分明的，横纹也很清楚，细胞数量不多可能是酶的浓度有些小或者是酶解时间短造成的，消化结束后最好再用溶液冲洗一下心脏再剪下孵育，这样能减小酶对细胞的继续作用，溶液也会干净些。

细胞数量少与酶浓度和消化时间都有关系。可以适当加大酶浓度，延长消化时间。我的经验酶浓度9mg/30ml消化时间在10min左右。实验室不同，操作者不同，动物种属及个体不同，具体的浓度和时间都不同。最好固定一个条件，然后变换其他条件，摸索最佳条件吧。建议以本实验室以往的操作为参考。

115、各位前辈：

我分出心肌细胞复钙到1.0mMOL/l时有一些细胞开始收缩，但还存在一部分不动的，但是用细胞外液灌流时，细胞全都开始收缩，一会就都萎缩成团死亡了，这是怎么回事啊，我发现灌溜的细胞外液Ca离子浓度是复钙终浓度的1。8倍，怎么会这样呢？请前辈们指点，小弟在这先谢了！

正常台氏液的钙离子浓度为1.8mM。分出地心肌细胞经过复钙后几乎有一半死亡。一般会让细胞在1.8的液体中至少待30分钟以上，也有人称之为耐钙细胞。如果死亡的较多，可以减少酶解时间，提高细胞的存活数。

还有就是你的细胞氏保存在什么液体中的？一般可以放在高钾kb液中，这样细胞就可以存活较长时间。

116、我分离的VSMC在电极接触过程中，总是随着电极的下降移动，不能形成很好的封接。这和细胞的活性或贴壁时间有关系吗？有些老师建议在盖玻片上涂多聚赖氨酸，还有的建议在外液中加 laminin,请问这有用吗？或者我能采取什么更好的办法？

不知道你的平滑肌细胞贴壁在什么地方，一般玻璃的比较好，但一定要干净，泡泡酸，干净些，贴壁才劳些；另外，就是细胞酶解再稍稍过一些。如果还是不行，就只好在盖玻片上涂多聚赖氨酸了。

117、1)请问各位大虾谁有从事T淋巴细胞钾通道膜片钳操作经验.

2)本人进行T淋巴细胞钾通道膜片钳检测已1周发现如下问题请帮忙:

A)玻璃微电极直径与淋巴细胞直径相差无几,封接时,T淋巴细胞周长1/3已与玻璃微电极接触,T淋巴细胞很容易被吸入玻璃微电极,有何良策.

刚分离之T淋巴细胞封接时阻抗可最高到达400MΩ,第二天无论如何,也达不到10MΩ,我说的是玻璃微电极与淋巴细胞接触后,有时未接触到细胞反倒达到100MΩ,但不管怎样也不会达到所须巨封接10GΩ,有何良策.实在是没有办法,T淋巴细胞被吸附于玻璃微电极,细胞膜都破了阻抗仍不升,巨封接实在困难.

C)悬浮细胞如何缝接，是否也需要斜向下穿刺细胞，我一直平行穿刺细胞，也可以吸住T淋巴细胞，但到底是否能缝接上。

3)西交大医学院及4医大我已经到处打听了,好象没人作过T淋巴细胞钾通道膜片钳操作,不知西安地区有无高人从事过同类研究,能提供指导,G!!!!!!!!!!!!!!!!!!

你也在做淋巴细胞，淋巴细胞直径一般为6-8微米，我最近在做单核细胞，我没有把单核细胞和淋巴细胞分开，所以电极很容易被淋巴细胞堵。当电极入水电阻为3-5M时，开口和淋巴细胞大小就差不多。

第一个问题是因为淋巴细胞在体外存活时间有限，你可以加些培养基，但是在37度时细胞代谢很快。注意液体的渗透压。“有时未接触到细胞反倒达到100MΩ”可能是电极堵了。

我看过有人做过T淋巴细胞钾通道膜片钳操作，好象是白求恩医大的。我也刚开始做膜片钳，多交流吧。

118、最近痛苦死我了，我做海马神经元whole cell膜片钳，不知为什么最近酶解细胞状态总是不好。要么渣子很多细胞少，要么细胞膜不光整，反光不好。请各位战友给予帮助。

另外请问，用CdCl2阻断钙通道，多大浓度合适？最大可加到多少？

估计你是做急性分离海马神经元的whole cell.海马神经原的急性分离的确是个较难把握好的问题，从动物的选材，组织的切片，消化，分离，溶液的配置等诸多环节都必须掌握好，就我的经验，动物最好选择出生2周以内的新生动物，取材动作要快，最好5分钟之内，当然越快越好，取出的脑组织立即入0-4度的氧饱和的人工脑脊液中5-10分钟，待脑组织稍变硬后再取材，注意在切片过程中要尽量不要挤压脑组织，并注意通氧。切片在抚育过程中要尽量减少切片的上下翻滚，另外，要注意酶的选择，如用胰酶，要注意不用含钙镁离子的脑脊液配制，并尽量现用现配，消化时间的把握也很重要，消化时间过长过短对神经原的活性都有影响，消化过后要将酶充分洗净，其次在吹打过程中要注意用不同管径的管子顺序吹打，吹打的力度要把握好，吹打过程中管子不要移出液面，以免形成气泡，影响细胞的活性，各种用液的PH值及渗透压也要很好地把握。就你的情况，如果其他条件控制得好，估计是消化时间不够或吹打力度不够。总之要根据自己的情况，多练习，才能很好地把握以上问题，一点经验，仅供参考。至于第二个问题，查查文献。

119、不知各位做膜片钳的前辈中，有谁都做过急性分离的平滑肌细胞，我做的是肺动脉。在此，想请教各位前辈几个问题：在消化血管的过程中，如何判断消化的程度，是单凭肉眼观测血管块的状态还是在显微镜下观测组织消化的程度。判断组织消化是否恰到好处有什么标准吗？如果消化过度是不是也不能 吹打出细胞，我现在不知道我分不出细胞究竟是消化过了还是消化不足，请前辈指教。

我正在做。如果你做的是大动脉，确实很难分，中小动脉相对来说还好消化，得到的细胞也多，凭肉眼完全可以判断消化程度，但是这一定是在有经验的基础上，不过只要你看一眼别人做过的，你就会得到感性的认识，对自己的实验帮助很大。消化过度，也可吹打出细胞，只是都是状态不好或死细胞，在显微镜下也可以看见平滑肌细胞。

120、细胞封接很好，但是破膜之后还没来得及高兴就掉了，有时是慢慢的掉，5－10分钟Rs降到几个M欧，有时干脆就一下掉到底。掉的时候有时细胞是溶了，但有时细胞看起来很完好的。除了电极的问题之外，还有可能是哪些原因导致？如何解决？？最近一段时间细胞分的还算漂亮，但是有时特别漂亮的细胞也会狂掉。

Rs 越小越好的

细胞容易掉的原因很多，只能一一排除，如果负压破膜，尝试负压大一些，再看看。另外，还是细胞膜的状态

今天发现，台式液的pH值在通氧前后，发生了很大的变化，通氧前为pH7.36，通氧后居然变为pH7.05，我想通氧对其影响较大，在此请教各位大侠，有没有比较好的可以控制pH的方法？还有这种pH的改变对细胞的状态是否有很大的影响呢

121、请问配制电极内液时先调PH值再加Hepes还是hepes等全部加好后再调PH值

另外渗透压要调吗

全部配好后在调ph值。如果有渗透压仪量一下最好，没有的话，可估算一下。一般按照文献配，渗透压应该不会差太远。

122、今天做实验时，方波没有了，大家遇到过吗？能否帮我分析一下？

我也遇到过方波没有的情况，不知道是不是和你的一样,我们是EPC10.我们都是将增益减小，这时方波就又出现了，但是有可能再将增益加大就又不见了，所以需要不断地点AUTO，总是会恢复的。这个问题的原因有可能是盐桥的问题，提示你的盐桥可能要重新做一个了。

123、分离豚鼠心室肌细胞,总是满布颗粒,不知道是什么缘故啊?什么原因会引起相关损伤啊?我们温度是36摄氏度,PH7.35,压力80CM水柱,酶是胶原煤1(GIPCO)浓度为0.5MG/ML???????????

你试着调整一下你的胶原酶的用量，我觉得你的细胞可能是分离过渡。或者你还可以试着加点蛋白酶E减少一点胶原酶的用量。我也是做豚鼠心肌的即兴分离，开始总是不稳定，后来每次尝试着变换一点用量，试着试着就开始逐步稳定了。还有因为你买的酶的批号不一样可能前后也存在差别，总之还是要边做边摸索。

124、请教各位大侠，我们最近一段时间分离大鼠心肌细胞总是得不到很好的细胞，看起来还可以但是做起来很难，有时候封接还可以但是破膜以后就不行了，电阻狂降，几乎就没有什么好的结果。而且有时候即使一切都还不错，记录的电流就不太像钙电流，看形状倒是有些像钠电流，但是在记录L钙电流的条件下应该不会记录到很明显的钠电流啊，很怪，出现率很高，我们也不清楚到底事什么，请大家帮我们分析分析，还有就是细胞状态一直不好，可是一切条件我们都和以前一样的啊，猜测会不会事天气的原因，进来我们这里非常热，还有什么可能的原因想不出了，请大家帮帮忙，多谢多谢！

我认为你纪录到的是钙电流,心肌细胞钠电流时间很短,10几毫秒,幅度大于5nA.夏天做实验确实很不容易,继续努力吧.

我做过人心房肌细胞的Ik1，常常会记录到钠电流，是因为封接电阻不够，我想你肯定是因为细胞状态不好，封接电压没有达到2G欧姆以上，才出现这种情况，建议下次同时加4-AP阻断钠电流，4-AP不稳定，需要现配。

125、阻断Na电流应该加TTX吧?

不一定要加TTX，只要protocal在钳制在-40mv达200ms以使钠通道失活，再以+10mv诱导出L型钙电流，这样就肯定不会出现钠电流。

126、请教各位同仁,做膜片钳快速给药时,一定要把细胞用电极提起来吗?

这样看你的给药系统，如果是美国产的DAD系统，给药切换就非常方便，只要将给药头靠近细胞就行了，不需要把细胞用电极提起来。

细胞用电极提起来做膜片钳啊? 应该是快速给药后把给药电极提起来吧，防止给药电极漏药

127、我也在分大鼠的心肌细胞，已经分了3个月了，可是结果非常不稳定，相同的条件，时好时坏。而且，我感觉大鼠的心肌细胞之间连接紧密，灌流的时候心脏变大不明显，而且从来没有出现拉丝的情况，不知为什么。

现在天气比较热，即使有分离出看着不错得细胞做实验效果也是不好得。大鼠得心脏灌流时是不出现拉丝得，豚鼠心脏会出现拉丝，一般几分钟就可以看到得。大鼠心脏酶解时也有变大，主要是心脏会变白，变可以观察到得。而且有时候会有异常短时间变大变白，几分钟内会有，原因不明，这样得是不会有可用得细胞得。

128、还有个问题就是分离的细胞药物干预不是看即时作用，该怎么做啊？我看到有的文献上将药物与细胞共孵育5-9个小时（比如ACEI类），这样可行吗？而且这样就不是同一细胞的前后对照了，可以吗？请各位前辈指点！



顺便问一下：有没有用RT-PCR做心肌离子通道mRNA水平和用WESTERN－blot测通道蛋白水平的兄弟姐妹啊？有事请教！

药物干预分离细胞一般是共孵育几个小时得，可是时间长短不好控制，因为分离得细胞在体外存活是有一定时间的，而且分离下来后要死亡一大部分。一般孵育时间不易过长。至于对照，一般是同一次分离的细胞分出对照组，给药组，或者其他的，这样应该没问题。我也想做RT-PCR心肌离子通道mRNA水平检测，提过mRNA，有降解现象，分离细胞不太好提，目前尚在摸索。

129、国内淋巴细胞L型钙通道的研究甚少，不知哪位兄弟姐妹做淋巴细胞钙通道的全细胞膜片钳技术，急性分离的活的人外周血淋巴细胞游走性大，如何固定，固定剂对细胞膜通道的功能有无影响，请兄弟姐妹们不吝赐教。

国内就没有几家淋巴细胞膜片钳做得好的，有点难啊。

要研究淋巴细胞L型钙通道啊? 淋巴细胞有L型钙通道表达吗? 表达多吗 (我没详细查过这方面资料)? 估计即使有表达也不多，全细胞电流估计不会超过50 pA。

淋巴细胞的贴壁固定倒不难，培养皿用poly-L-lysine包被一下即可，多聚赖氨酸浓度不要太高，低于 10 microg/ml 即可，包被过夜，第二天吸干就可以用了。poly-L-lysine对细胞膜通道不会有影响。

130、我的经验电阻会随电极液配方改变，但是在哪里能找到理论依据呢？

不同的电极内液各种离子浓度和成分不同，而不同的离子扩散速度、电导是不一样的，所以不同的电极内液电阻不同

膜片钳之实验操作篇



131、请问有没有哪位师兄师姐是做的培养的窦房结细胞的膜片钳实验？记录的那种离子通道？我是以为新人，而且不是学习电生理专业的，希望大家帮助！

你如果要做窦房结细胞的好，请用兔子等大动物，大鼠的窦房结细胞细胞是很难分离的，记录的哪种离子电流那要看你实验需要了。

132、我在分离豚鼠心室肌细胞形态很奇怪,细胞整个缩小,比平常要窄很多,满布颗粒和空泡,如果细胞能量受损,通常是水肿混浊啊,有没有什么情况会导致细胞受损,而整个细胞却缩小呢?

很可能是你配的无钙液渗透压过高所致 ,仔细核对一下你加的各种溶质是否正确,特别一不 小心算成原来剂量的10倍,或者干脆重新配制溶液。

133、电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。

解决方法：1） 适当增大电极的口径，以利于破膜；

2 ）电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；

3 ）灌注电极液的器具也要保持洁净；

4 ）电极现用现拉；

5 ）电极下降入细胞外液时给予一定的负压防止此过程中灰尘堵塞电极

134、国内淋巴细胞L型钙通道的研究甚少，不知哪位兄弟姐妹做淋巴细胞钙通道的全细胞膜片钳技术，急性分离的活的人外周血淋巴细胞游走性大，如何固定，固定剂对细胞膜通道的功能有无影响，请兄弟姐妹们不吝赐教。

国内就没有几家淋巴细胞膜片钳做得好的，有点难啊。

要研究淋巴细胞L型钙通道啊? 淋巴细胞有L型钙通道表达吗? 表达多吗 (我没详细查过这方面资料)? 估计即使有表达也不多，全细胞电流估计不会超过50 pA。

淋巴细胞的贴壁固定倒不难，培养皿用poly-L-lysine包被一下即可，多聚赖氨酸浓度不要太高，低于 10 microg/ml 即可，包被过夜，第二天吸干就可以用了。poly-L-lysine对细胞膜通道不会有影响。

谢谢了，国内少数人做过钙通道，L型该通道国外有很多报道，国内据我所知还没有人做。

135、我现在正进一步摸索分离细胞的条件，但是感觉很不稳定，而且有时分出来的细胞看着很漂亮，可是做膜片钳的时候一破膜电阻就掉到几十M，所以我觉得看似好的细胞实际也不一定好，这样一来就不知该怎么判断了，还请大家帮帮忙啊，有什么好的建议啊?多谢多谢！

我主要做神经细胞patch，心肌细胞也试着做过几次，觉得比神经细胞容易啊。

确实，细胞看着很漂亮，但不一定patch就好做。破膜后掉，关键还是细胞膜状态不好。细胞膜弹性好，patch就好做，你试着用电极压压细胞，看能否出现明显的“酒窝状”凹陷，若有，细胞状态应该还可以，此时破膜后掉，就可能是电极尖端开口直径不当，或负压、zap破膜有待改进。

如果是细胞状态不好（多半是这个问题），可重点从两个方面考虑进行改进:

1）. 酶消化程度：不可太过，能分散到足量细胞即可；

2）. 吹打分散：尽量轻柔，次数不宜多，注意吹打的吸管前端开口大小应适当(2 mm)，且进行抛光。

136、还有个问题就是分离的细胞药物干预不是看即时作用，该怎么做啊？我看到有的文献上将药物与细胞共孵育5-9个小时（比如ACEI类），这样可行吗？而且这样就不是同一细胞的前后对照了，可以吗？请各位前辈指点！

顺便问一下：有没有用RT-PCR做心肌离子通道mRNA水平和用WESTERN－blot测通道蛋白水平的兄弟姐妹啊？有事请教！

springcoming wrote：

药物干预分离细胞一般是共孵育几个小时得，可是时间长短不好控制，因为分离得细胞在体外存活是有一定时间的，而且分离下来后要死亡一大部分。一般孵育时间不易过长。至于对照，一般是同一次分离的细胞分出对照组，给药组，或者其他的，这样应该没问题。我也想做RT-PCR心肌离子通道mRNA水平检测，提过mRNA，有降解现象，分离细胞不太好提，目前尚在摸索。

但是也有人说分离的细胞个体差异比较大，这样的对照不准确，不知道是不是这样？

我想问一下师兄是不是做单细胞RT-PCR，为什么是提分离细胞呢？不能直接提取组织吗？

提取mRNA用细胞和组织都可以的，培养的细胞要先消化下来再进行提取，分离的可以直接处理提取，这个和实验设计有关。我不是做单细胞的，是分离细胞的体外急性实验，一般也就几个小时。

137、请问各位战友，谁做ATP依赖的钾通道啊，能否传授一些经验，正在摸索，没有头绪啊，不胜感激

我做心肌细胞KATP电流

我一般先用开放及剂100uM pinacidil先使其开放，用特异性阻断剂10uM glibenclamide完全阻断，证实我所记录到的是KATP电流

在100uM pinacidil先使其开放的基础上再给予所需研究的药物，观察该药物对KATP电流的影响

我的外液配方是(mM) 140 NaCl , 5 KCl , 1 MgCl2 , 1 CaCl2, 10 Hepes

电极内液配方是(mM) 140 KCl， 5 EGTA，5 Hepes，10 KOH，1 MgCl2 ,

1 Na2ATP, 0.1 GTP

138、电极压细胞压到什么程度再加负压比较好呢？也就是阻抗升到多少再加负压？比如入水阻抗是5M。



封接破膜时负压的情况根据不同细胞类型（如心肌、神经元、淋巴细胞），以及培养、急性分散、组织切片的情况不同而不同，主要依据经验。如培养的神经元，脉冲方波下降1/3~2/3时即可破膜。一般电极接触细胞后电极再适当下降少许即可。可配合镜下看电极压细胞情况确定，当出现“酒窝”状凹陷时即可施加负压。

139、非常想请教一个问题：记录KATP电流内液加不加Na2ATP的问题？

因为KATP通道是ATP依赖性的，ATP浓度升高时，通道关闭，那么为什么记录内液中还要加ATP呢？我的理解是加生理浓度的ATP为了防止rundown现象，但是其浓度应该如何把握呢？所加的浓度的大小依据是什么？是否单纯根据文献吗？另外与细胞类型关系大不大呢？

我不做KATP，也没看这方面文献。觉得电极内液加ATP不会影响KATP通道。想一想啊，ATP影响KATP，是从胞外还是胞内起作用？

不过电极内液光加ATP减少rundown作用也不大，应加能量系统，请查阅相关文献。为了省钱，不加ATP也行。

非常感谢您的回答，但ATP是胞内影响的，因为能量增加（ATP增加），关闭KATP通道，ATP是细胞内产生的。

记录KATP电流内液是要加Na2ATP的，KATP通道在无ATP溶液中表现衰减现象，即先开放，随后逐渐丧失活性，ATP可恢复衰减的通道活性。KATP电流与细胞类型也是有很大关系，我一般参照影响因子5分以上做同一种细胞的文献，按照它的配方配制电极内外液。

140、哪位前辈给鉴定一下我分离的大鼠心肌细胞怎样?

我怎么封不上,给负压时,没什么反应,有时仅升到二三十兆, 有的电极接触后会跳动, 然后死掉. 请问这是怎么回事, 应该怎样改进? 郁闷!

我感觉你这个细胞状态不好，首先感觉边缘圆钝，这就说明细胞贴壁不好，四周已经翘起来了；还有感觉细胞表面纹理不是很清晰。看来还要继续摸索分离方法啊。

141、细胞很容易高阻封接，但一破膜就掉，请问除了细胞的原因，还有其他原因吗

你可以试试下压电极再狠点，一般电极电阻变化在一倍左右，即方波下降一半时。当然，细胞状态是要好的，这是前提。

142、哪位前辈给鉴定一下我分离的大鼠心肌细胞怎样?

我怎么封不上,给负压时,没什么反应,有时仅升到二三十兆, 有的电极接触后会跳动, 然后死掉. 请问这是怎么回事, 应该怎样改进?

你这个细胞不能算不好，但是做膜片的细胞选择最好是长梭形的，一般细胞电容在100pF左右的，也就是说不能太长，这样说吧，比你这个细胞再长1/4~1/3，但要再窄1/3，为好。下压电阻要力量大些。如果给负压没反应，可以用外液冲的时间长些，因为膜表面可能有你看不见的东西附着着，多冲意味着使其膜表面光滑些。电极接触细胞跳动是正常现象，那是细胞不耐钙后致死的缘故，至于改进，没有好办法，就是再找耐钙的细胞。

143、你指的0.03%胶原酶2加0.1%牛血清蛋白什么时候用呢？你们不用胰蛋白酶么？一般是用多少呢？我们是sigma的试剂。

我们不用胰蛋白酶的，就是无钙液灌流清洗过心脏后灌注的酶液由无钙液配成，含有0.03％的胶原酶和01.％的牛血清蛋白。我们用的酶是invitrogen公司的。

144、分大鼠心肌细胞的朋友们：有个问题请教一下大家，你们在充氧的时候用的是纯氧、还是95％O2和5％CO2的混合气？有什么理由吗？

这取决于你的ＰＨ缓冲剂是什么．如果用ＮaＨＣＯ３做缓冲就需要通95％O2和5％CO2的混合气，如果只通纯氧，ＰＨ会上升，ＮaＨＣＯ３变为ＣＯ３根和溶液中的钙形成沉淀。如果用ＨＥＰＥＳ，则仅需要通纯氧，通95％O2和5％CO2的混合气，则CO2变为Ｈ２ＣＯ３，ＰＨ会下降。并且纯氧相对便宜。

145、我也正准备做豚鼠的心室肌细胞分离。请教各位前辈，豚鼠的心肌细胞分离和大鼠是不是差不多？所用的灌流液、KB液和消化液的配方是不是也和大鼠的差不多？若有配方可发给我嘛？

我们实验室用豚鼠，我试过同样的配方分离大鼠心肌细胞，分下来的细胞不理想．我们的配方是：

（1）无钙台氏液(mmol-1)：NaCl 130，KCl 5.4，KH2PO4 1.2，MgSO4 0.5，HEPES 6.0，Glucose 10.0，PH=7.4 with NaOH

（2）有钙台氏液(mmol-1)：NaCl 137，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5，HEPES 6.0，Glucose 5.0，PH=7.4 with NaOH

（3）酶溶液：无钙台氏液+0.4mg/ml collagenase+0.1mg/ml protease

（4）贮存液(mmol-1)：KOH 70，L-glutamine acid50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，PH=7.4 with KOH

146、请教做大鼠心肌细胞的前辈们 ，我做了一段时间的分离心肌细胞，分离的效果不怎么好，经复钙后，大部分死亡，要不然就是细胞活性不好，封接不上。

我的具体步骤如下：

1.在冷的无钙台式液中剪去多余组织

2.无钙液灌流5分钟

3.无钙液加5mg蛋白酶E 5mg一型胶原酶 50mg BSA共50ml 灌流20至30分钟不等

4.KB液灌流5分钟

5.保存在30mlKB液中复钙备用

我们实验室一个老师说，他们都不复钙，直接将分离的细胞静止几个小时后就观察，请问这样可以吗？是不是酶量太少而灌流时间过长影响了细胞的活性？具体如何复钙效果比较好？另外酶液中加低钙具体是多大的？（这样分离的细胞是不是就耐钙些）

我分离过豚鼠细胞,我的经验是:

1.不要急于复钙,细胞分下来后就在KB液中保存,PATCH时复钙就行.即使分下来的细胞很好,复钙后1h也会死50%以上,时间越长,活的细胞越少.

2.胶原酶量可能有点少,一般文献酶液灌流时间都在8-15分钟左右(豚鼠).不过出产酶的公司不同,酶的活性也不一样,这个需要你自己摸索,我觉得***的酶比什么SIGMA的要好很多,活性高,分下来的细胞干净.

3.酶液中不必加钙.因为一般蛋白酶中都含有一定的钙,有文献说0.1mg/dl蛋白酶中的钙的浓度正好发挥胶原酶的活性.我试过,不管加多低的钙,分下来的细胞都不好!

147、问个幼稚问题，做平滑肌细胞的急性分离时候整个过程是否需要注意无菌操作？分离的细胞一般能保存多久？如果有细菌会不会有影响？

急性分离应该不用无菌操作,分下来的细胞一般可以用3,4个小时,好的时候能用7,8个小时。

148、请教各位：分离大鼠心肌细胞过程中，灌流液在充氧前后的PH值会有很大的波动，不知是否在充氧一段时间后还要校正PH值，这种波动该怎样解决呢。

大概能偏差多少呢？只要ph值在7.2-7.4间影响都不会很大的，我们没有测过氧饱和前后究竟有多大差别，如果你的偏差很大就只有配溶液时稍微把ph值向相反的方向调了。不过所用的都是缓冲液啊，应该不会变化很大的，你可以检查下你所用的缓冲盐是否出现问题。

你如果是急性分离大鼠心肌细胞，灌流液用的应该是台氏液吧。而且台氏液书上也有几种配方，不同的配方，也就是含有不同种类的缓冲对，氧饱和需要通入的气体也不一样，有纯氧或者混氧，具体书上很清楚，只要缓冲对和通入的气体匹配，一般在灌流前调节PH值达7.3左右，然后氧饱和不会对PH值造成多大影响。我们一直就是这样分的，没有问题。

149、大家好，有和我一样做大鼠心肌细胞的朋友们，我想请教几个问题。

1.我的kb液怎么会配下来很偏酸（3.几）

配方是这样的：L-Glutamic acid 70 KCL 25 Taurine 20 KHPO4 10 Mgcl 3 EGTA 0.5 Glucose 10 HEPES 10

2.我用25MG 的一型胶原酶，1.5MG的蛋白酶，分下的细胞还是很漂亮，但就是封接不上，我的细胞没有复钙，这样可以吗？能帮我分析原因吗？

1.你的配方是从何得来？从配方看就是偏酸的一个溶液，因为L-Glutamic acid挺多。实际上配方应该是用谷氨酸钾，但谷氨酸钾在碱性环境下不易溶解，易析出沉淀，所以在配制上常用L-Glutamic acid，溶解完全后，逐渐加入KOH调pH值。 我的KB solution (in mM): KOH 85, L-glutamic acid 50, KCl 30, Taurine 20, MgCl2 1.0, KH2PO4 30, HEPES 10, EGTA 0.5, Glucose 10 (pH adjusted to 7.4 with KOH)，供参考。

2.封接不上和没有复钙有关。我们知道，Ca2+的二价阳离子在很多情况下起两个负电物体连接的媒介作用。以前我们也试过不复钙，因为这样对细胞的损害小，镜下细胞很漂亮，但封接很困难。复钙以后，虽然细胞死亡一些，但封接就容易了。以前在中文文献上也看过有不复钙的，但国外文献很少见到。

忘了ＫＯＨ了吧？你的液体里不用ＫＯＨ，当然是酸性的．

我一般都是封接前半小时到１小时复钙的．．．封不上的原因很多，要一点一点排除，很难给你更多的建议。

150、我做的大鼠心肌细胞，封接时达到吉欧却老是不稳定一会甚至几个吉欧，一会又兆欧，因此没法破膜，请问这是什么原因？怎样解决？我作了半年了，还没记到电流！

封接时达到吉欧却老是不稳定,这是正常现象。封接时给负压后，电阻达到G欧，只要它波动的幅度最小也不低于700～800M欧，不必管它，稍微等一段时间，稳定一下，就可以破膜了。一般破膜后电阻还会下降一些，这也是正常的，只要有500M欧左右，就绝对能记录出电流了。

首先，破尖端膜前的封接电阻虽然有波动，但不能小于700～800M欧以上，封接好后，放掉负压，封接电阻应该不会掉下来才行，否则还不能算是封接好。如果实在是波动太大，也许电极应该抛光（polish）一下，或者拉制的参数改变一下，使电极尖端更平整一点，毛刺少一些。第二是破膜时，负压给慢一些，不要快速抽负压。这样再试试吧。

151、请问您能告诉我您是怎么复钙的吗？文献中都没有详细的说明。我现在也存在同样的问题，不是细胞封不上，就是封上了但一破膜就掉到几十M。真不知该怎么办才好，明年就毕业了，可现在还没膜出来，大家帮帮忙吧。

复钙很简单。不知你们的细胞槽能不能灌流，如果能的话，把细胞悬液滴在里面，静置几分钟，待细胞贴壁后，然后用含钙的细胞外液（一般就是台式液）灌流几分钟就行，既能冲掉细胞悬液中的杂质，便于下电极不堵，又复了钙。如果是简单的用培养皿作细胞槽，不好灌流，那就在试管装细胞悬液时，静置，细胞下沉于管底时，把上清夜用吸管吸掉，再加入含钙的细胞外液就行。

也有人喜欢用逐步复钙法，就是配置几个不同钙浓度的细胞外液，逐次从低到高用上述办法复钙，这样对细胞损伤小些。我是一般一次就复钙到位，因为省事，虽然对细胞损伤大些，但好细胞已足够用，就偷懒不愿费事。你可以根据自己的情况把握。因为细胞外液中钙浓度很低，所以液体中其它成分不用变，一般是不会影响渗透压和pH值的。

关于电阻波动，AgCl电极不好也是一个很大的影响，镀AgCl电极的方法，前面已有很多帖子描述了，象电镀、84液氧化等，可找有关帖子看看。

封接时，一般下电极压在细胞上电阻升高30～50％就够，压的太狠不行。然后就可以抽负压了，如果是用注射器抽负压，一般用10ml的，抽之前，里面预留5ml左右的空气，这样抽负压时有一个缓冲，负压不会给的过猛，抽负压时，也不用太大，一般缓慢抽1ml到1.5ml左右就行。这在Axon放大器的说明书也有说的。如果电阻上的很快，说明状态很好；如果缓慢上升，可以等几分钟，让它慢慢升至G欧水平，我最长等过15min也有封上的。如果这样上不去，即使再给大的负压也没用，即使封上了，破膜时也会掉的。这些经验是指急性分离的心肌细胞，培养的细胞和神经细胞好像也有给负压挺大的。仅供参考，还是要靠自己多摸索，试试不同的封接手法。封接好后稳定一下，破膜时，注射器中的预留空气排空再抽负压，但抽负压时也不宜过快过猛，否则电阻很容易又迅速掉下来。很多书上说给一个快速的脉冲负压破膜，其实未必适用的。

复钙稳定一段时间后，心肌细胞如果有收缩运动的，我是不用的，以前的经验好像封接成功率不高，给负压后挛缩成一团死了。

其实关于复钙的问题，我是这样认为的：两种方法都可以，也就是一步复钙法和分步复钙法。我们一直都使用的是一步复钙，这样细胞的耐钙性没有分步复钙法的好，因为分步的方法毕竟可以使细胞具有一定的耐受性。但是可以这样想一想，虽然一步复钙大多数细胞都在收缩，显示出不耐钙，但一个浴槽里有几个甚至一个耐钙的细胞就可以了，这个耐钙的细胞必定不错，因为他经历了严重的打击都没有受损。一个槽子里有太多的耐钙细胞，真正对我们试验也没有什么意义，因为一个槽子里也只是选择成功一个细胞而已。

152、记录钙离子通道电流的时候，怎样判断记录的就是钙电流，而不是其它通道电流？

电极液中已加过TTX和TEA-Cl，用不用再判断记录电流为钙电流？

什么是反转电位？

有好多种钙电流的 电极液配方，应该选用哪种好一些，大家怎么判断该选用何种配方？

判断记录的是不是钙电流有以下几种方法：1）把外液换为无钙液（其他离子浓度不变） 2) 加氯化镉看能否完全阻断钙电流 3）加维拉帕米看能否基本阻断



反转电位你可以通过IV曲线来算，意思是钙电流从内向转变为外向时的钳制电压

钙电流的 电极液配方你可以参照影响因子高的杂志即可。

简单的看的话,做一个I-V曲线看看,如果基本符合的话,差不多就是.但是这样做不够严谨,只能做初步的判断. 严谨的话还是加硝苯底平一类的钙离子阻断剂。

还可以用一些钳制的电压，使其他通道失活。反转电位，你也可以理解为I-V曲线中，电流为零的电位。

153、我是新手，用的CLAMPEX7.0软件，请问破膜后MEMBRANE TEST 中的Rm和Ra的意思，破膜后到底该监测哪个的电阻？还有补偿后Ra会变到几百，这有关系吗？另外做心肌细胞膜片钳时，需要一直灌流吗？还有我的HOLDING LEVEL设成零，行吗？

Rm是膜电阻的意思，就是从细胞内液到细胞外液之间由于细胞膜隔离造成的电阻。Ra是接触电阻，就是access的意思，不好翻译，是电极的电阻。由于细胞膜在各种离子通道未开放的时候是不导电的，所以Rm要是封接好的话应该在G欧以上，要是比较小的话，说明封接不好，有漏电流产生，这时Hold那里的电流就会很大，那里是显示一般要在100pA以下记录较好。Ra当然越小越好，一般要在100以下，破膜以后如果它逐渐的增加，说明有膜的融合。不知道你明白没有。

当然要一直贯流，要不细胞代谢的产物不排除，会伤害到细胞的 。

看来你还真的是个新手。Holding当然有根据测量的通道不同、刺激的方案不同而不同，哪里有千篇一律的阿 。好好读读文献吧。膜刀不误砍柴工。

154、如果是使用Axon的机器的话，慢补偿最大是3pF，所以由的时候电容太大的时候就补不上去了。我用的放大器是EPC9，什么原因造成电容大呢？怎么处理？

造成电容大的原因有很多,简要的说可以有以下几个方面:

1.系统的电容,就是机器本身的电容,这个是比较难改变的;

2.电极内液充灌不要太多,只要电极有1mm浸入就行了,多了增加电容;

3.电极不要弄湿了,增加电容和干扰;

3.有条件的话电极可以涂树脂防止液体由于表面张力延电极上爬,同时增加电极表面厚度,减小电容;

4.灌流槽的液面尽量低.就是减少电极浸入的长度,这一点对电容的影响较大.但又不要太少，否则液体由于蒸发作用会自己干掉的,国外有的液体特薄并在表面滴一层硅油防止液体蒸发;

以上是几个比较常用的方面,另外系统的屏蔽也很重要.

155、关于细胞不好破膜的原因,分析 可能为:

1）. 抽负压来破膜,看你给多大的负压,一般自己都有自己的经验,我通常使用5ml的注射器,给0.5~1cm的压力,都会破的,否则,就不好做了,即使破了,也容易掉下.意思就是首先排除自己手法的原因.

2）. 可能就是细胞消化的不够,膜还比较坚硬,结实.

就你而言,你可以首先检查一下抽负压管道,看是否密闭完好,如果没有问题,那么你在封接好细胞之后,给的负压力度比以前稍大一点看看.还不行的话,就要从细胞本身找原因,可以增加胶原酶的量,或者增加消化时间都是可以的.

156、我测钙电流的时候，开始的时候电流是正常的，R－series一般是15M以内，但测了4组电流以后，电流就变的很不正常了，比正常电流要滞后，而且偏小，R－series超过了40M。但电阻值始终是比较高的，一般都在1G以上。

请问有没有人碰到过类似的情况，请问是什么原因阿？我不清楚是封接的问题还是仪器出毛病了，有没有哪位大侠了解的？

很可能是破膜后又部分封起来了，所以R－series增大，时间常数变大，导致钳制电压改变，钳制速度慢，所以引出的电流要滞后，而且偏小。

157、请问，我做大鼠心肌细胞膜片钳时，破膜后进行补偿，能将线补平，可是随着时间的推移，补平的线又变的不平了，电流也比开始的时候小了，而且越来越小，不好说是药物的作用还是膜又融合了的原因，我用力抽后，线会又平了，可是到后来就抽不平了，请问这怎么解决呢？我为什么总是遇到这样的情况呢？

你的问题主要是破膜后膜融合造成的。融合后导致***电阻值的增加（如果你使用的EPC－10放大器的话，可以看的到具体数值），随之会导致电流值的降低。当然电流越来越小也有可能是细胞本身电流的衰减造成的。如果你使用的是EXON等放大器的话，***电阻值是看不到的。但原因还是由于膜融合造成的。所以想办法解决，给你一个建议，可以降低电极电阻，也就是拉制电极时降低拉制温度，使电极尖端变粗，破碎的膜片就不易堵塞尖端，这样***电阻就会稳定一些。做上细胞之后再去反复抽负压是不可取的。

158、还有个问题测钙电流时候，为什么好多配方要用钡离子作为charge carrier ?请各位了解的朋友分析一下？

这主要是因为L型的钙离子通道有calcium induced channel inactivation，而Ba2＋既可以通过钙通道又没有calcium induced channel inactivation，在I－V曲线上表现出来的电流强度要大于用Ca2＋的，简单说是为了便于出结果，因为有时候用Ca2＋作为charge carrier 的电流太微弱，不容易记录到，当然如果电流不弱，我也见到文献主张用Ca2＋的，因为毕竟还是Ca2＋符合生理情况。

159、我分离的大鼠心肌细胞,经过在4摄氏度放置8小时后,换到电极外液后大部分细胞老跳个不停,我怀疑是电极外液的问题,因为放在别人的浴液里就不跳了,大家能帮我分析一下吗?谢谢.

我做钙通道,外液配方:

Nacl 135 cacl2 1.8 cscl 4.6 Mgcl2 0.5 HEPES 5 GLucose 10

还有一个也不行,

Nacl 126 cscl 5.4 Mgcl 1.0 NaH2PO4 0.33 Glucose 10 HEPES 10 Cacl(2H2O) 2.0

放在别人的外液里不跳很可能是别人是无钙液的缘故，解决的办法心肌细胞分离后逐步复钙，复钙后在室温下放置1-2小时即可，在4摄氏度放置8小时时间过长，反而对细胞不好。另外再优化细胞分离的条件，如胶原酶浓度、消化时间、温度、PH值等，使细胞尽量状态好一些。特别是消化时间不宜过长，温度不宜过高。另外我个人觉得sigma的胶原酶I比worthington的胶原酶II分离的细胞耐钙程度好，祝成功。

160、新手求教一个问题，液接电位怎么补偿，如果是EPC10，是事先计算输入数值补偿，还是实验完毕后再分析，如果是200B应该怎么做。感觉好多人对液接电位补偿不是非常清楚，只是按一下auto键使基线调零就可以了，但这种补偿并不适当。

首先声明一下：我也是新手，只是说一说自己的看法。若有不对，希望大家指正。我认为液接电位也是一种直流电，因此在AXON 200B上，直接使用电极电位补偿就可以补掉液接电位；而在EPC上，AUTO 自然也是相同的作用。还有就是在实验过程中，并没有产生基线漂移的现象，这也间接证实了电极电位补偿就可以补掉液接电位。

161、新手作膜片钳不成功，总是能找到很多原因，不知到底是哪一步的原因。首先会想是不是配液出了问题，因为发现参考文献上各自的配液都有一些不同，即使经典的台式液都会有一些成分的不同，不知该选择哪种。所以帖子中关于配液成分的问题很多。

其实，关于配液问题不必想得太复杂。最基本的原则就一条：

1. 液体成分尽量符合细胞内外液的生理环境，渗透压和pH值在正常生理范围。比如全细胞模式，灌流的细胞外液高钠，可以用台式液，pH值为7.4；电极内液符合细胞内液成分，高钾，pH值为7.2。为维持pH值，一般都会添加HEPES等缓冲物质。根据实验模式的不同，又有所调整，比如贴附式，电极内液也应该是高钠。

由于实验的需要，溶液成分还有所增减：

2. 全细胞模式为了防止rundown现象，里面需要添加ATP和GTP，既能供能，又是第二信使的前体。如果实验要持续30分钟以上，还要考虑添加GTP再生系统等。

3. Mg2+在信号转导过程起重要作用，所以往往会添加。但二价离子会在细胞膜两侧形成屏障作用，影响记录电流的大小，所以溶液中二价离子浓度不能太高。故全细胞模式电极内液还常常添加EGTA等络合Ca2+以控制钙的游离浓度。

4. 由于一些有机大分子常常很难溶解，配方中添加要多考虑。

另外就是具体实验的需要，溶液配方还会有所变动：

5. 比如记录钠电流，很大，达20nA，会超出放大器的范围，所以外液中要减少Na+离子浓度，用其它有机阳离子成分替换一部分Na+；

6. 为防止钾电流对实验所记录电流的干扰，用Cs+替换K+；为抑制钙电流，加入Cd2+等；

7. 记录钙电流，为增大电流，防止过快衰减，还喜欢用Ba2+替换Ca2+；

8. 记录Cl-电流，用F-替换Cl-。

不一一赘述，这些都可以查阅有关文献。在更改配方时，要始终注意渗透压和pH值，除非你的实验是要观察pH值或渗透压对电流的影响。另外还要注意所添加成分之间是否会出现反应产生沉淀，比如用Ba2+替换Ca2+，那溶液中显然不能有SO42+。

对于新手来说，没必要多管这些，最好的办法是参照相关文献配就行，而这个文献应该最好是国外SCI影响因子高的，一般是不会出错的，所有这些问题它都应该已经考虑清楚了。如果还作不出来，那就考虑其它的因素吧。

162、做大鼠心肌细胞膜片时，遇到以下几个问题，求教：

1.电极尖端总是吸附杂质和死亡细胞，怎么解决？

2.细胞复钙后死亡率很高，文献上提示逐步复钙，请问具体方法，浓度和时间是什么？

3.电极入液后，给予一定的正压，以防止尖端阻塞，正压一般是多少？而给予负压封接，一般又是多少？

1.电极尖端总是吸附杂质和死亡细胞，那是因为你用细胞外液灌流不够，多冲洗灌流一下就能将杂质冲走，而状态好的细胞则能紧紧的贴壁而不被冲走。只用这样才好封接。

2.根本不需要逐步复钙，我们做的时候，把细胞滴在玻片上，贴壁几分钟后，就开始用细胞外液灌流复钙，马上就有细胞做，逐步复钙简直是浪费时间，看来你还需要在分离细胞上多下功夫啊！

3.电极入液后，我一般给10CM水柱的正压，这样可以吹开小渣子，而给予负压封接时，10到20CM水柱的负压即可，细胞好的时候瞬间即可上去，负压太大了不好。

163、我还没到复钙细胞都死了。分离大鼠心室肌细胞时用蛋白酶E吗？原来只用胶原酶时还有些细胞，但是不多，高倍镜下每视野1－2个，现在加了蛋白酶E0.03mg/ml，胶原酶的量降了一半0.25mg/ml，仅消化3－4分钟，就有很多细胞，但是过一会就都死掉。我得KB液：KB solution (in mM): KOH 70, L-glutamic acid 50, KCl 40, Taurine 20, MgSO4 3.0, KH2PO4 20, HEPES 10, EGTA 0.5, Glucose 10 (pH adjusted to 7.3 with KOH).现在真不知道原因了!?

分离大鼠心室肌细胞时用蛋白酶E吗？

并非需要两种酶同时使用，如果你使用一种酶就可以消化到很好的细胞，那么另一种可以不用。文献上报道两种酶同时使用是方法的问题，并非要模仿，可根据自己的实验条件和情况而定。

仅消化3－4分钟，就有很多细胞，但是过一会就都死掉。

1.考虑酶过量，可下次实验减少酶量；2.考虑酶消化时间过长；3.实验温度，以及KB液pH值。

建议：可以边实验边观察细胞状态，这样有利于你提早摸好实验条件，但尽管这样，我发现心肌细胞的分离实验可重复性不好。

164、<关于心肌等细胞 存活时间短，状态相对不佳 的一点经验。>

心肌细胞膜片钳实验时，原则上细胞外浴液（我们用台氏液）应该用氧饱和，这样有利于细胞较长时间存活，并且状态相对较好。但是，我们为了省事（呵呵，科研来不得半点懒惰）多数时候不用氧饱和外液，细胞存活时间和状态也还凑合。这里建议，园友们，当你实验中的心肌细胞在台氏液等外液中存活时间短，又或者状态不佳的时候，应该尝试将外液氧饱和。

另外，实验环境的温度（根据所作细胞不同略有不同）和酸碱度也会影响细胞的存活和状态，电磁信号干扰也是潜在原因之一。 ^_^ 如果哪位还有问题，我愿意和大家共同讨论，交流，一起进步。

165、有高手做过脑片穿孔膜片钳吗?请问穿孔剂(两性霉素和加入穿孔剂的电极内液是否应作超声处理?具体怎样作?另外,充灌内液时有何注意事项?封接情况怎样?全细胞状态如何?



我未做过脑片，但用过穿孔液，两性霉素B要先在二甲亚砜中溶解，具体比例可以试试，我们常用的是两性霉素B浓度200微克每毫升，以1毫克两性霉素B加入5微升二甲亚砜比例配置，两性霉素B要在超声振荡器振荡中使之完全溶解后再吸取5微升二甲亚砜两性霉素B母液加入5毫升电极液，此过程要快，并在超声振荡器中进行，保证电极液中没有大块的两性霉素B析出，若有析出，可试用注射器抽吸使大块的两性霉素B被打碎，呈悬浊液，这样两性霉素B终浓度为200微克每毫升。若这个浓度无法穿孔，可以尝试增加每毫升二甲亚砜溶解两性霉素B的量，使两性霉素B终浓度达250微克每毫升，但要保证二甲亚砜在电极液中的含量不超过0.15％。若无法配置如此高浓度的两性霉素B，你还可直接购买sigma公司已经配置好的两性霉素B溶液，直接取两性霉素B溶液加入电极液中即可。

166、请教一个问题，我做急性分离细胞，有两个问题，一是细胞贴壁不好，应该怎样封接呢？ 二是破膜困难。 那位高手帮忙解答一下

我觉得1：细胞贴壁不好可以用多赖浸泡载玻片

2：破膜困难可以考虑适当延长消化时间，增加负压，一般来说，如果消化适当的话，那么细胞是比较容易破膜的，不过前提是你的电极要拉的好。

167、请教各位大虾，我用的是axon 200b的放大器，可是基线漂移现象很明显，约有300PA，所以想请教大家是什么原因造成的?

我也是一个新手，造成基线漂移可能有很多原因，不过你可以先检查两点最基本的：

1）电极镀银情况如何

2）每次玻璃电极刚进浴液时， 是否很好的用pipette offset 调零了。

168、我是做大鼠心肌细胞的。分细胞这块还算好，现在问题主要是钳住细胞后封接阻抗总上不到G欧，吸不动的感觉但有负压，总找不到原因，还请各位赐教。

1、负压大小要合适

2、细胞状态好，包括分离出的细胞表面光滑，干净，横纹清楚等；

3、外液温度，PH控制合适

4、电极避免被阻塞，尤其细胞表面，而且电极抛光，内液过滤

5、细胞耐钙性不好

169、请教各位大虾，我是一个新手，请问做背根神经节神经元的膜片钳时，电压是钳制在多少？另外，破膜困难，有时吉欧封接后稍吸，掉到十兆欧左右，请问是怎么回事，请各位赐教。

钳制电压在-70 ~-90 mV均可，根据你的实验目的确定。

DRG神经元破膜困难：是急性分散的DRG神经元吗？若是，破膜困难主要是酶消化不够，可适当延长酶消化时间，特别在冷天。可在消化时适当摇动消化液。但应注意要使神经元活性好，取材要尽量迅速，低温，必要时供氧。

若是培养的DRG神经元，主要是神经元状态不够好，应摸索改善培养条件。总之，主要是细胞的问题!

170、各位前辈，我刚开始做膜片钳不久，我有三个问题想请教一下：

1 破膜后细胞在一两分钟内即死亡，除了和细胞状态有关外，还与哪些因素有关？与细胞内外液渗透压以及细胞内外液PH值关系还大啊？

2 细胞内液的PH值是不是一般都调到7.2啊，还有调到7.4的啊？

3 漏电流太大是不是会影响电流的形态，甚至记录不到想要记录的电流啊。像100PA的电流允许最大的漏电流是多大啊？

１．与液体关系非常大，尤其注意细胞内液．

２．7.2-7.3，因为一般接近细胞内正常ＰＨ．

３．漏电流太大肯定影响结果，我感觉对内向电流漏电大一点还能忍受，外向电流漏电大了你很难区分是你要纪录的电流还是漏电流．我感觉仪器正常工作的话，１００ＰＡ的电流漏电流至少要小于１０ＰＡ．

171、各位前辈,请教各位,有谁用过两性霉素B做过穿孔膜片钳的?我现在在用两性霉素B做,但是有时过了20多分钟,还未得到电流,我的电极尖端是蘸的不含两性霉素B的正常内液,后面冲灌的是含两性霉素B的内液,两性霉素B的浓度是200微克每毫升,都是新鲜配置的每3小时换一支.

是不是穿孔要比破膜的难很多呀!



不会吧？应该很好破膜的啊。我们一直在用啊，很好用的。是不是你的药有问题啊？另外，配置母液的时候要避光的啊，电极尖端蘸的正常内液也不能太多了，否则影响二性霉素向电极尖端的扩散。另外要保证完全溶解哦，不一定需要过滤的，有些滤膜可使二性霉素失活呢。我们一般在不到5分钟就搞定了呢。终浓度和你的差不多，有时候能用两天呢，一样能穿膜。

172、　我做视皮层脑片，最近老出现电极一接触细胞外液提示overload，请问是怎么回事？

一般来说是基线漂移的原因。把gain打小，补充液接电位，在把gain打到1。如果还是overload，可以把gain打到最小，补偿液接电位，如果补不完全，就要重新电镀参考电极。

173、有问题请教大家:

1, 新鲜分离的成年大鼠心肌细胞电极一接触上去细胞就死了，除了细胞状态不好还有其他什么原因？

2，可以做膜片钳的心肌细胞镜下看有什么特征？

3，若用新生乳鼠心肌细胞做膜片钳，是用带有小玻片的培养皿养细胞吗？培养瓶可不可以？

4，刚从培养皿拿出来的带有新生乳鼠心肌细胞小玻片放到膜片钳裕槽之前要经过什么处理吗？

1、最最主要的原因是你的细胞状态不好，除非你的电极内液渗透压有问题

2、细胞呈杆状、横纹清晰、无自主收缩

3、不一定非要用带有小玻片的培养皿养细胞，也可以直接培养的6孔板那种孔径大小的培养皿里

4、一般不用经过什么特殊处理，培养的新生乳鼠心肌细胞离开孵箱时间不能太长，否则状态不行，最好液体温度能维持在37度。



1、电极接触细胞后细胞死亡可能是因为消化过度引起的，另外与上电极时的操作精细度有关，一般应缓慢将电极移至细胞表面，不可动作过大。

2、理想的心肌细胞特征有：边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩。

3、做培养的细胞时一般用盖玻片，这样方便取出细胞，培养瓶瓶口太小，盖玻片放进取出困难，一般用培养皿。

4、一般取出盖玻片后无需特别处理，若表面有杂物可先用PBS轻轻洗涤几次。

174、请教一下.做膜片钳时慢补偿一直不好,和哪些因数有关啊?

与LJ(液接电位)关系还大啊?LJ 到底是什么,如何计算最合适的值啊?一般做钾电流时(快激活延迟整流钾电流)LJ 应该设在多少啊?

所谓液结电位，是指两种溶液界面的电位差，每种溶液的化学成分是不同的，由于具有不同迁移率的阳、阴离子跨越界面时，产生电荷分离从而产生电位差，就生理溶液而言，这种液结电位的值常是几mv至约12mv之间。一般做钾电流时LJ 要看你电极内液的配方，可借助通用的Henderson方程进行计算。

175、问一个问题，我做了急性分离背根神经节全细胞膜片钳半年了，到现在仍然不入门，有的细胞轻轻的一吸就能封接上，但大部的都达不以吉欧封接。我想是细胞的问题，请问各位，急性分离的DRG要消化到什么程度才合适，进行全细胞膜片钳？

细胞消化到：镜下观察细胞圆或椭圆，胞质均匀，胞壁干净完整透亮有光圈感。封接难可能是消化不足，消化不均匀，细胞表面不干净等原因。消化时应在摇床上或消化过程中轻轻摇动离心管。

176、怎么没有人帮忙呢？知道大家都很忙，先谢谢了！还有就是最近的分离的细胞很好封接，很快就可以上G，可是破膜之后电阻就维持在200-300 间，几乎所有看着不错的细胞都是这样，这样的情况是哪一步做得不好呢？真的希望知道的朋友帮助一下啊！

细胞容易封接说明细胞状态、膜的表面应该可以，不知你破膜时吸的力道是否大了点，可以尝试着先用封接时的那种力道开始，不能破膜的话再慢慢加，如果不是这个原因那你考虑你的电极内液PH值、渗透压等是否有问题，以致一破膜封接电阻就掉。另外我觉得最好再把电极尖端抛光一下，虽然你高阻封接容易，但抛光后的电极可以使你破膜后封接电阻相应更高一点。

177、新建起来的膜片钳实验室，我做单个肿瘤细胞全细胞钙通道测定，反复出现一个问题不能解决，就是在电极接触细胞膜后轻微负压后立即出现G位封接电阻，可是电阻非常不稳定，变化非常大，屏幕上电阻的数值跳来跳去的，一会几百M，一会十多G，一会又几G，一会干脆没显示，就像电极尚未进入液体的断路状态，已经非常多这样的情况了，不知道是什么原因，该不该继续，试图吸破细胞膜，但往往再吸封接脱落，出现几十M的电阻。很可能是你的整个操作台稳固性不太好，特别是固定Holder的那一部分可能存在你觉察不到的漂移，这样的话电极会有很细微的前后或左右移动，使得封接电阻不够稳定，你可请公司的人再加固一下，把所有的螺丝旋紧，另外不知你的实验室在几层，楼层高了整个房子的微小晃动也会造成这种状况，最后再检查一下连接Holder用来破膜的塑料管的密闭性和畅通性，有时异常的气流动力学也是罪魁祸首。

膜片钳之数据分析



1、a. 在C-fast，和C-slow补偿的时候应该从哪些指标进行观察（尤其是还未开始记录时），以判断补偿是否合适？

应该主要从封接测试中的测试电流波形来观察常吧?电容电流很大或者补偿过渡都会有异常的图形出现 。

b. 漏减程序中的setting times（指第一个漏减脉冲施加前细胞处于Vsub的时间以及从最后一个漏减脉冲结束至步阶脉冲开始前细胞处于细胞钳位电压（Vh）的时间）在刘振伟的《膜片钳pCLAMP采样的P /N漏减分析》一文中并未明确指出应设计多长时间，只是说需要将其对记录电流的影响减到最小。那么这一时间应该怎样设制比较好呢？

好像在刘振伟的另一篇文献中提到setting times应该等于步阶脉冲时间．而Ｔ１即漏减脉冲之间的时间间隔应该大于步阶脉冲时间你在数据库中再搜索印证一下．慢电容电流补偿不好的话测试电流图形与基线不能很好的重合，过度补偿电容电流会出现反向的电流，即本来需要的电流是外向的却出现内向的，（电流有向下平移的倾向，个人总结），也有可能出现异常的钠电流，这一点在刘振伟的幻灯中曾经提到过。其他的文献很少，没有见到介绍settingtime的。正象在AXON的使用说明书上写的那样,不推荐在数据采集阶段对电流给与过多的补偿操作,否则可能会丢失一些有用的信息,误导最终的结果分析,或者整个的毁掉实验数据.在处理数据阶段,也有可以补偿漏电流的软件补偿,可以考虑使用.不过,我在记录数据是,还是主要应用COMMANDER上的漏电流补偿,在分析的时候具体分析在给予软件补偿..P/N补偿的确是不错的东西,不过操作不当,容易造成不好的影响,还是慎重考虑小心使用.

c. 下面图中记录到的有没有钾电流，是否受到电容电流的影响？应该如何排除电容电流的干扰？是否需要设置漏减程序，应怎样设置？如果对记录后的图像进行分析时应该怎样使用漏减。

　图中虽然外向的电流很大但瞬时漏电流很明显，如果封接电阻很小的话，根据Ｉ＝Ｕ／Ｒ稳态漏电流也会很大．稳态漏电流可以通过ＣＬＡＭＰＦＩＴ中的漏减功能给予消除但不适合于电压门控性离子通道的漏电流消除．参见刘振伟文献．pclampfit 做出来的图形copy到画图另存为jpg将图片格式改为jpg。

2、刺激伪迹过大及防止。1）尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。2）在动物体或标本上，尽量延长刺激部位 的距离，在刺激电极 和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小；采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。

3、问一个问题：大家有谁是在脑片上做EPSC的？我们的系统是用的ＨＥＫＡ，我知道axon有很多辅助的软件来统计用，但是HEKA上面很少，我现在为统计EPSC感觉很头疼，比如频率，幅度之类，一个个去手工检测太麻烦，请问大家有没有好一点的办法？

我在脑片上作过EPSC。我们用的是AXON200B，分析软件主要是clampfit，如果是做EPSC的话，分析幅值已足够，它可以将一群数据联成一个文件，只要你的刺激protocol是相同的，在选定的两个cursor之间，就可以计算出peak,slope等参数。据我所知，Igor也有相似的功能，它也可以将一桢桢的sweep进行群分析。我不知你为什么要分析频率，EPSC主要指的是诱发的电位，它和你的刺激伪迹是紧密联系的，所以并不存在频率的问题。

4、可能我没有说清楚，我记的是sEPSC，是突触前自发释放的event，所以分析频率是最重要的，IGOR好像比较麻烦，我现在在研究一个叫mini analysis的软件，是专门分析EPSC频率和幅度的，功能ms很强但这个是收费的，我只能用到demo版，很多功能实现不了，大家可以帮忙看看。下载地址：www.synaptosoft.com，我们可以交流一下这个软件的使用，呵呵。

这个软件非常好用，（我们一直都在用它……）

虽然是DEMO版，但是基本功能都已经具备了，包括你所要分析的频率等。最重要的是，它可以直接进行频率分析并作图。目前我们开发的功能也不是很多，有很多DEMO版可以使用的功能我们都还没有用呢，作为DEMO版，其最大的限制是在存储方面，它不允许数据的更改和保存，而其他的一些功能，你可以通过数据导出到EXCEL中进行后期处理。不过，我的感觉是，分析mEPSC实在是很复杂的一项工作，因为数据采集的关系，很多数据都不得不手动分析，我常常要花比做试验更多的时间来分析。

5、你好,请教一个小问题:怎样可以用AXON(windows)来记录诱发电位, 线路的连接和软件的设置如何？

诱发电位，不知你指的是胞内记录还是场电位。不管怎样，这两者在线路连接上是基本相同的。线路的连接，你们应该有Digitizer 的吧，与自发电位不同的是，诱发电位要将刺激器或者刺激隔离器通过DIGIDATA的Anolog output或者Digital和电脑连接起来，这样通过软件clampfit就可以给出刺激。如果需要复杂的刺激模式，你可以在刺激器上编程（具体要依据刺激器的说明书），再通过软件触发。软件的设置，场电位的话，打到I=0模式，whole-cell的话，可以选择I-clamp或者I=0，胞内记录我没做过，不知道。protocol编辑，和电流箝模式相配合，Inputs要改成单位是mV的，另外，Wave里要多加一个触发电平，加在刺激器的位置上。

6、我现在在分析时有几个问题：1.我是heca的系统，从pulse中把数据转换过来时，坐标轴的尺度就变掉了，很麻烦。2。不知道你们是怎么鉴别EPSC的，有些比较小的EPSC我很难跟干扰区别开来，你们是用什么标准来区别EPSC的？有些发放比较大，但其并不表现为快速上升缓慢下降，我不知道这些发放要不要计算在里面。3.用这个软件我觉得还是要一个一个event来重新鉴别，防止除错，这样工作量还是很大。。。你们是怎么做的？

1）、从来没有用过EPC系列的，数据转换我实在是不大懂；AXON的可以直接打开，但是我从来没有注意过坐标问题；

2）、分析mEPSC首要的一点就是确定阈值，换句话说，就是多大的波你才要，这个的选择要看你的实验结果了。一般我会选择比噪音水平高2倍左右的。但在同一次实验里，最好这些参数保持一致。

3）、这个手动分析是不可避免的，因为这个软件会把所有符合你的参数设置的波形都揪出来，而且有可能重复计数。所以我每次都会花更多的时间来分析数据。

4）、为了更好的学习这个软件，你可以到该公司的网站上下一个说明书，它会告诉你这个软件能做什么事。

7、那么对于有些点,peak值很大,但其decay相很快,就是说不满足快速上升和缓慢下降的形状,这种点怎么取舍?

首先，你有没有阻断动作电位的发放，换句话说，这个peak是否动作电位？这一点可以通过peak的时相进行初步判断。

其次，你有没有通过外加阻断剂的方式进行排查。如果你加了阻断剂后这种波形还存在，那可能是其他的递质发放，或者干脆就是干扰，不必计入你所要分析的波形的考虑范畴。

第三，一般说来，我在分析mEPSC时，对于不太确定的波形，采取的是跳过的处理方式。

8、为什么我们记得全细胞钠电流，其I-V曲线关系总是不对。经常是在-70或-80mv开始出现钠电流，但是是最大钠电流，以后随着电压增加电流减少。已经补偿过膜电容和串联电阻，还有什么原因？

首先要搞清楚你记录到的是不是钠电流，那么就用钠通道阻断剂阻断一下看看电流是否变化。有时候你记录到的可能是漏电流而不是钠电流。钠电流不应该是线性的，而是刚开始比较小，然后增大，之后再减小，呈"U"形，与钙离子通道相似。



出现你这种情况有如下几种可能：1）封接的电阻不够大，或者破膜后封接变的不严了。一般来说封接至少要达到4G以上才可以。如果封接的不严，不管你怎么补偿也难以记录出正常的电流。2）钳制电压有问题，也许你是按照文献上设置的，但很多对膜片钳软件不太熟悉的人容易弄错。你可以在软件中把你自己设计的protocol 图形预览一下，看钳制电位设置是否正确，如果不正确会导致钠通道失活，将无法记录出电流。以前我就见过一个人把这个给设置错了。改正后就记录出来了。

9、你有正版mini分析软件吗？

我们用的分析软件是Clamfit,axon公司的正版的软件，很好用。

把原理搞清楚对于正确设置参数很有好处，对于结果的理解以及写文章时的用词也很有好处。首先你要有一点电学知识，也不用太难的，就能把欧姆定律真正理解清楚就可以了，然后需要一点数学知识，理解二次函数。其它的也就没有什么，然后找一本比较好的膜片钳的书，好好读，就能明白。



做新分离的大鼠血管平滑肌细胞全细胞钙离子通道或钾离子通道难度确实很大，并且一开始的频繁失败很容易让人泄气，以为这是不可能做成的，甚至怀疑别人是否真的能做出来。但要有信心，确实是能做出来的。我从最初的无法分离出单个细胞，到最后成功记录出全细胞钙、钾电流确实遇到了很大困难，但最终在高人的帮助下，以及自己的刻苦努力下，终于做了出来。



关于破膜问题，用负压吸引还是能破开的，并且记录的也很稳定，但成功率很低。根据我的情况，分离细胞成功率大约70%，封接成功（电阻达到2G左右）率大约20%，封接成功后破膜成功（指破膜后封接稳定）率大约30%，破膜成功后能成功记录出电流的细胞大约30%。这样算下来成功率为0.7x0.2x0.3x0.3=0.014,就是说平均成功率1.4%。具体说就是一天也就能做出2-3个，就算很星云的了。用二性霉素穿孔，我没有尝试，但据说更难成功。

还是坚持负压吸引吧。

10、whole－cell recording的液接电位的补偿问题

我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成giga－cell后，就不能在调节pipe－offset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。

我本来是测钠电流的，没想到出现上面的结果，好像怎么看都不象一个正常的内电流。问题在哪里？

1 ）细胞外液为钾，钠，钙，镁，内液有氟化铯和氯化铯，请问液需要避光保存吗？

2 ）因为配液浓度都不大，所以即使用电子天平，测量也比较困难，几十毫克的东西，难免有误差，请问内外液的离子浓度一定要非常精确吗？

3 ）内外液的PH值要精确到什么程度？ 因为文献有的说要7.4，有的又是7.3，影响应该不是很大吧?

根据我的观察，你的钳制电位好象是0mV,因为钠通道在0mV会失活，所以根本记录不出来正常的钠电流，你记录到的很可能是钙电流或者是残存的钠电流。请你重新检查一下你设置的protocol。我以前就帮别人解决过类似问题。产生这种情况的主要原因还是你没有把膜片钳原理弄清楚。

如果我没有看错，应该是你把保持电位（holding potential）弄错了，本来应该是-80mV,而你设置的好象是0mV,钠通道在0mV大部分是失活的，所以你不可能记录出来电流。重新设置。

试剂浓度当然要精确，你可以一次多配一些就是了，比如配1000ml，把用量特别小的可以先溶解成100倍浓度，使用时候加溶液就可以了。

PH一般对电流影响不是太大，至少7.3与7.4相差不大。



内外液的离子浓度一定要比较精确才行哈，膜片钳的原理就是测试细胞破膜后，在一定条件下产生的细胞电流。可想而知，电流的动力的来自于细胞膜内外的电化学梯度，所以你的内外液的离子浓度不精确的话，结果一定不对。起码不准确。



关于PH，应遵循凝酸勿碱的原则。因为细胞外液偏碱的话，细胞的活性会有影响，偏酸的话则对细胞的影响不大。所以没有精确的PH计的话 往往宁愿配的液体PH不到7.4 。我一般只调到7。2最多。但是写文章的话还是当然要写7.4的。

11、激活曲线公式：

gCa/gCamax={1+exp[-(vm-vα1/2)/kα]}-1

失活曲线公式：

ICa/ICamax={1+exp[(v-vi1/2)/ki]}-1

这是L型钙通道电流的公式，详见附件。请问上面各项（gCa；gCamax；vm ；vα1/2； kα；ICa；ICamax；v；vi1/2；ki）的含义及怎样求上述各项

G为电导，G=I/(V-Vrev），Gmax 为最大电导。

Vm为测定激活曲线，通常用IV曲线的刺激电位。

Ica为记录得到的失活电流，ICamax为其最大值。

vα1/2、 kα、vi1/2、ki为该公式的拟合参数，可以用sigmaplot进行曲线拟合后得出。

12、我想用膜片钳做心肌细胞钙离子通道电流的测量，我做的是全细胞模式的，不过做了4个月了还是没有测到过钙通道电流。不知道是什么原因。

我们用的细胞是新生SD大鼠的心肌细胞。电极是国产的，没有抛光。细胞内外液成分是按照文献上写的配的，不过没有调节PH值（不知道这个影响大不大）。放大器是EPC10，我们破膜也是用负压吸破的，没有用ZAP。我现在还没有开始用灌流系统。

测电流时没有出现钙电流曲线，而且电流值会随着电压的增大而增大的。

你的问题很多，首先在做全细胞记录的时候电极可以不抛光，但抛光的话你会发现封接的好一点！现在有几个问题我想搞明白的：1，现在你究竟做到了那一步？是不能封接，不能破膜，还是不能记录出来电流？其实即使你封接阻抗也不会很高的，因为你的细胞没有处理好！培养的心肌细胞膜上会有很多的杂质，不驱除的话封接不会很好。所以我建议你加上灌流系统进行灌流。2，你设置的Protocol是什么？Holding Potential 设置了多长时间？有没有达到钙通道足够的复活时间？3，电流值随电压的增大而增大，这样的电流值不是通道电流，你一定明白，通道电流有一定的I-V关系，记录的可能是电容电流和漏电流！4，我想提醒的是，pH值至关重要。记录钙电流的时候它关系到钙离子的络合状态进而调节钙离子的浓度和Rundown，所以应该好好分析一下原因！我相信一定可以做出来的！

13、我看的有关于用膜片钳检测离子通道的文献基本上都是阻滞被检测通道以外的通道，然后认为测得的电流就是该离子通道的电流了。好像没有讨论不同的离子通道之间的关系的，比如钠、钾离子通道的开、闭对钙通道的影响等，这是什么原因呢？我觉得不同的离子通道之间应该不是完全独立的啊

其实这个问题也不难理解，因为两个通道的电流叠加在一起的话就很难分析了，并且验证一个通道电流有很多的方法的，比如钠电流，首先它有自己独特的脉冲激活条件，再次要用TTX来验证这个电流！不过我认为你这个Idea特别特别的好，多数研究注重一个通道电流的特性，而忽视了不同通道的关系。我认为出现这个问题有几个原因：1），多数研究是电压门控的通道，这一类通道主要依靠闸门电流来激活通道电流，互相之间的关系可能不是很大，2），同时记录两个或两个以上电流脉冲很难控制，记录的电流可能互相影响，就没有办法分析了，比如激活，失活曲线！3），有的电流是没有办法同时记录的，钠电流和钙电流同时记录就不能分清楚彼此了，但钾电流可以和钠电流一起记录，4），在电压门控模式下谁能说的清楚是电压的影响还是通道电流彼此的影响？

我认为这个Idea有以下几个方面值得研究：1），一个通道变化引起离子浓度变化对另一个通道的影响，如心肌细胞膜上的钙通道开放引起胞内钙离子浓度的变化进而激活肌浆网上的钙通道引起钙释放，2），一个通道变化引起自身通道的变化，比如延迟整流钾电流的产生据推测是镁离子的屏障作用，谁能保证钾离子浓度的变化不对自身产生整流作用，3），一个通道变化引起的电位变化对另一个通道的影响，最典型的例子是钾通道的变化引起静息电位（或最大舒张电位）的变化对钠电流的影响了！4），配体门控通道之间的互相影响，这个中间很复杂，需要理顺。可以肯定的是钙离子作为第二信使对各个通道之间一定存在调节，不过这种调节在心肌细胞上不是很多。

14、V0.5和K是如何求得的，用origin 软件嘛？如何拟合Boltzmann 方程？

膜片钳软件里面都有这个功能。比如clampfit软件就能拟合。最好请教身边做过的人，否则很难处理成功。用origin 软件很好做得。首先做出散点曲线，如激活曲线，失活曲线，然后用S型曲线去fit。会给出如下结果：

Data: Data4_B

Model: Boltzmann

Chi^2/DoF = 0.00025

R^2 = 0.99918

A1 1.00676 \(177)0.0076

A2 0.03278 \(177)0.00759

x0 -85.14026 \(177)0.31465

dx 4.61757 \(177)0.24917

Xo=V1/2

Dx=k

15、激活与失活曲线拟和原理相同，公式相同，不过失活曲线 相对步骤少了一点，因为失活曲线 拟和用的就是电流，不需要计算，而激活曲线的G要通过计算得出来。

具体G的计算公式是G=电流/（钳制电位-反转电位），所以在钳制电位为0的时候分母并不是0，而如果钳制电位刚好是反转电位的时候，由反转电位的定义可知道这个时候电流为0，0/0结果可以是任意数字。其实真正计算的时候你根本不用考虑这个问题。一般到了反转电位的地方都到了激活曲线的100%的地方了，可以参考前后两个点确定。

关于拟和曲线参数的意义，字母V当然是钳制电位了，这是已知数，Vh，是半数激活电位，就是在这个电位下，整个细胞中有一半的要分析的离子通道处于开放状态，k，斜率，表示离子通道开放比率随着电压变化的速率，越大，表示递增越快。

如果说具体步骤，简要说明如下：激活曲线

1）.先得到一个细胞的全细胞I-V曲线

2）.I-V曲线U形顶点右侧应该为直线，该直线与x轴的交点就是反转电位（电流为0时的电压）

3）.计算各刺激电位下的G，公式G=电流/（钳制电位-反转电位），有几个刺激电位，就得出几个电导数值，例如

V -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40

G 0.2 0.5 0.9 1.8 2.9 3.5 3.5 3.5

r 0.06 0.15 .... 1 1 1

不用我说最大电导就是3.5，一般来说最后几个刺激电位处电导应该都接近Gmax。

4）.计算个刺激电位下通道激活比率，

5）.然后把电压和r两列考到clampfit等软件中，用公式Bolzman方程拟和，拟和的过程中需要设置几个起始参数，你可以自己摸索，直到能顺利得出S形曲线，然后到参数一栏中，就能看到我们想要的Vh和k了，保存好这两个数值和拟和后的理想数值（就是各电压下拟和出来的曲线的r），然后拟和下一个细胞。

失活曲线拟和方法就是节省了步骤1，2，其它基本相同

一般来说任何通道都可以做激活曲线拟和，但要做失活曲线拟和，该通道电流必须是具有失活特性的，一般阳离子通道均具有这个特性，如钙离子通道。

16、向各位前辈请教关于激活与失活的问题：V0.5和K是如何求得的，用origin 软件嘛？如何拟合Boltzmann 方程？？

这是曲线拟和的问题，可用的软件很多，象Prism或Sigmaplot都可以作，Clampfit也可以作，但由于它的说明书没有详细怎么介绍，摸索起来麻烦一些。用Prism或Sigmaplot比较容易。以sigmaplot8.0为例，打开软件，把你测得的数据输进去，一栏输电压值作X，一栏输电流（或电导）值作Y，点击Stastistics → Regression Wizard，在Equation category中选择Sigmoidal，在Equation Name中选择Sigmoida，3 Parameter。然后点击下一步，按要求把X，Y值配对应的数据栏，就行。

16、请问使用EPC9、EPC10的朋友

如果我要了解形成全细胞模式后细胞的静息电位，是不是在电流钳模式下将电流调为0后切换或电压钳，界面V-MENBRANE上显示的就是静息电位？！我分离的是心肌细胞，怎么用这种方式测出来才-15mv啊，我想我配的电极内液没有问题。

我用的是AXON，但仪器的原理是一样的。电流钳模式记录的就是电压值，测静息电位是在电流钳模式下。应该是在形成全细胞后，迅速倒至电流钳模式，钳制电流为0，电脑输出的就是静息电位值。至于你再倒至电压钳模式下，界面V-MENBRANE上显示的应该是你设置的钳制电压值，只不过由于serial resistance以及液接电位的缘故，会和你设置的钳制电压值略有些差异。

17、在膜电容的计算公式Cm=τ cⅠ0/ΔVm(1-Ⅰ∞Ⅰ0)中，我们的膜电容电流已经测出，但是如何通过膜电容计算公式用clampfit进行拟合分析并得到膜电容时间常数和稳定膜电容电流值，从而计算出膜电容值。我们采用的是Axopatch200B和Version6.0版膜片钳！

你把软件升级到8.0版，里面有一个Membrane Test，可以直接告诉你膜电容。

18、我在电极内液和细胞外液都用了TEA-Cl，仍然没有记到Ca电流，是什么原因？

说明:

1）.封接电阻>2G 欧

2）.破膜电阻400-800M欧

3）.钳制电位-50mV,1 run, 64 sweep, -40-0mV去极化刺激间隔30s

4）.电极内液中含20mmol的TEA-Cl,细胞外液中没有

5）.电极内液用KOH调PH到7.4

6）.细胞外液用含钙台氏液

那么你记录到什么电流呢？有钾电流吗？TEA只是抑制掉你引出电流中的钾电流成分，使你引出的钙电流突出一些。如果你的细胞本身什么电流也没有，加不加TEA，都是一个结果。

我曾经用大鼠引Ito，由于钙电流抑制不完全，在电流图像起始先看到一些向下的内向钙电流，然后被向上的外向钾电流掩盖。说明细胞好，封接好，这些电流都应该出来，重叠在一起。加抑制剂只是把这些电流分开来。

所以，首先你要确定你的细胞比较好，封接也好，可以引出电流，不论什么电流。如果这一步都达不到的话，你还是检查检查细胞的问题，封接有没有问题，钳制方案设置有没有问题。

如果只是钙电流出不来，能引出钾电流，那有可能封接还不太好。相对来说，钾电流封接电阻在细胞破膜后有100多M欧，就能引出来了。而钙电流必须要破膜后将近200M欧，才能看到钙电流。

另外还有一个可能是你加入TEA浓度比较高，改变细胞渗透压环境或pH，使细胞状态差。



根据我个人经验,您记录的应该什么电流都不是,而是细胞没有封接好的漏电流.一般细胞如果封接的很好,破膜后,如果钳制在-80mV附近,通道都没有开放,电阻应该很大,至少要2G左右的.你的只有400M欧姆,显然太小,所以漏电流很大。

漏电流的特点是IV曲线基本是一条直线,粗看起来各原始曲线之间间隔基本相等,就如同你提供的一样的.并且如果此时采用P/N 漏减技术的话,电流基本都会消失,就是各原始曲线都回到基线,而对应的IV曲线基本重合于水平轴.

我不知道你们破膜后-80电位下的电阻都有多大,如果很小的话,比如100M,那么当我们增加10mV的刺激电压时,单纯漏电流就是10mV/100M=0.1nA=100pA,这个电流可不是很小的,因为平滑肌细胞的钾离子通道电流最大也不过1000pA,如果是这样,你的漏电流就远大于你要的电流了,怎么可能得到可靠的通道电流呢.

一般封接后电阻最好能大于3G欧姆,破膜后也要在1G以上(-80mV钳制情况下).如果是钳制在0mV情况下那就另当别论了

P/N漏减，P就是刺激电位的意思， pulse，就是指你每一次给的刺激电位，比如依次从-60mV到+60mV，Step 为10mV,那么这些电位都是刺激电位，

N是个自然数，一般取2-8，常用的是4，当然要根据通道的特点选择。

P/N漏减的意思就是在正常的刺激电位前（或后）给予N个1/N大小的刺激电压（预刺激），比如N=4时，在给+40mV 刺激电位之前先给4次10mV的刺激电位，然后将这4次得到的电流加在一起，然后再从该正常刺激电位（+40mV）得到的电流中减去前面4次预刺激电流之和。

原理是：如果电位为漏电流，它应该是线性的，就是I-V曲线应该是一条直线，如果是通道产生的电流，它应该是非线性的。

这样在P/N的较小电位刺激下，一般不激活通道，只能得到线性部分，再将N次叠加，就得出该刺激电位对应的线性部分电流（漏电流），从总电流中减去漏电流就得到通道电流了。

补充：线性函数的特点是f=n*f(x/n),比如y=8x这个函数。而其它函数就不符合该特点。

说的可能不是很清楚。通电产生气泡是因为没有绝缘嘛

19、最近很郁闷，分离出的细胞老是很糟糕，破膜后所记录到的电流老是忽大忽小，作出的I-V曲线就老是会左移右移，是不是这样记录出来的电流就没有什么意义了啊？

问题出在什么地方呢？

是不是和你灌流有关系，你试一下记录电流的时候关掉灌流。

可能是，破摸后膜片有重新堵住RUPTURE的口。故电流忽大（开放）/忽小（堵住）。建议使用阻抗更小的电极。（这个问题我也遇到过，不过用小阻抗电极后，就OK 了。

20、稳态失活曲线应用双脉冲刺激参数获得。保持电压-80mV，条件脉冲从-90mV，每隔10mV连续去极化至0mV，持续时间1s，然后再给一去极化至0mV，持续时间200ms的测试脉冲。

请问：为什么平时做膜片钳实验的钳制电位一般都是-40mV的，而在文献中做失活曲线的实验中保持的钳制电位要-80mV或-90mV？

为什么要然后再给一去极化至0mV，持续时间200ms的测试脉冲？在制作失活曲线时有何作用？

我估计你看的肯定不是一篇文献,我看到的就有失活曲线-40 holding的啊.

由于L- CA通道会受很多其他通道的影响,所以-40 holding是为了消除NA通道,这个电位下大部分都失活了,但是如果你的细胞内外液里都没有NA 或者加了足量的TTX的话,就没有这个必要了,完全可以用-90holding的,这个时候就可以测T- CA了.

稳态失活的原理是测量该通道在经历了不同电位的除极后对后一次除极的影响,也就是两次除极之间的影响,所以当然有第二次0 mv的过程了,再着你可以仔细看看它的电极内外液里肯定没有NA的存在,并且还有TTX.



膜片钳之数据分析篇.doc (79.0k)