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shRNA设计原则
shRNA设计原则
发布时间:2015-01-17 来源:
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shRNA
实验成功不得不看的
shrna
设计原则大总结
RNAi
由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。
其中
shrna
设计在慢病毒的构建上应用颇广,本文对
shRNA
设计原则和操作技
巧进行介绍。
1.
克隆到
shRNA
表达载体中的
shRNA
包括两个短反向重复序列,
中间由一茎环
( [shRNA shrna
设计原则
寡核苷酸
酶切位点
聚合酶
]
RNAi
由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。
其中
shrna
设计在慢病毒的构建上应用颇广,本文对
shRNA
设计原则和操作技
巧进行介绍。
1.
克隆到
shRNA
表达载体中的
shRNA
包括两个短反向重复序列,
中间由一茎环
(loop
序列分隔的,组成发夹结构,由
pol
Ⅲ
启动子控制。随后在连上
5-6
个
T
作
为
RNA
聚合酶
Ⅲ
的转录终止子。
2.
两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3.StrataGENE
发现
29
个寡核苷酸较之原先推荐的
23
个寡核苷酸可以更有效的抑
制目的基因。
4.
在启动子下游的酶切位点下方紧连一个
C
,使插入片段和启动子有一定空间间
隔以确保转录的发生。
5.ShRNA
目的序列的第一个碱基必须是
G
以确保
RNA
聚合酶转录。
如果选择的
目的序列不以
G
开头,必须在紧连正义链的上游加一个
G
。
6.ShRNA
插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列
的茎环都被成功的运用过。
其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测
带
有
shRNA
插
入
片
段
的
克
隆
。
在
比
较
了
众
多
不
同
长
度
和
序
列
的
茎
环
,
5'TCAAGAG3'
序列最为有效
(AMBION use
。
7.5-6
个
T
必须放置在
shRNA
插入片段尾部以确保
RNA
聚合酶
III
终止转录
(stop
。
8.
在正义链和反义链序列上不能出现连续
3
个或以上的
T
。这可能导致
shRNA
转录的提前终止。
9.
从转录本
(mRNA
的
AUG
起始密码开始,寻找
“AA
或者
NA”
二连序列,并记
下其
3'
端的
19
个碱基序列,作为潜在的
siRNA
靶位点。正义链和反义链都采用
这
19
个碱基
(
不包括
AA
或者
NA
重复
来设计。
英杰公司总结的
siRNA
和
shRNA
成功必知:
在使用
Stealth? RNA
前优化转染条
件,在每次实验中都实验
BLOCK-iT?RNAi
系列产品,应用
RT-PCR
进行实验结
果分析,
知道你想抑制的蛋白质半衰期,
始终包含适当的阳性和阴性对照,
按照
标准准则使用
Stealth? RNA
对
siRNA
进行分析。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/034305a7360cba1aa811daa0.html
《shRNA设计原则.doc》
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